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Jul 02, 2023

Cuantificación de la absorción de nanopartículas fluorescentes en células de mamíferos mediante un lector de placas

Scientific Reports volumen 12, número de artículo: 20146 (2022) Cite este artículo 1988 Accesos 1 Citas 5 Detalles de Altmetric Metrics De acuerdo con la rápida expansión de las aplicaciones de nanopartículas,

Scientific Reports volumen 12, Número de artículo: 20146 (2022) Citar este artículo

1988 Accesos

1 Citas

5 altmétrico

Detalles de métricas

De acuerdo con la rápida expansión de las aplicaciones de nanopartículas, se requieren diversas herramientas para investigar cómo interactúan las nanopartículas con entidades biológicas. Se han desarrollado muchos ensayos para medir la absorción celular de nanopartículas, pero hasta ahora la mayoría de los métodos son laboriosos y a menudo no cuantitativos. Aquí desarrollamos un método de medición cuantitativa robusto y de fácil acceso del nivel de absorción celular de nanopartículas marcadas con fluorescencia utilizando un lector de placas. En el diseño experimental, se identificaron y abordaron posibles problemas que podrían provocar variaciones en las mediciones. Por ejemplo, la variación en la intensidad de la fluorescencia de las muestras debido a diferencias en el número de células se normalizó a la densidad óptica, que es un valor físico correspondiente al número de células. El número de lavados y la temperatura de manipulación de las muestras se optimizaron para minimizar la interferencia de las nanopartículas residuales y la posible salida de nanopartículas de las células, respectivamente. El ensayo desarrollado se demostró con la línea celular de linfocitos Jurkat para medir la absorción celular de perlas de poliestireno de 50 nm marcadas con fluorescencia, y su aplicabilidad se confirmó aún más con la línea celular de carcinoma de pulmón A549 y otra línea celular de linfocitos RPMI8226.

Los avances recientes en nanotecnología brindan diversas oportunidades en las industrias de atención médica1, alimentos2 y cosméticos3, al tiempo que plantean preocupaciones sobre su posible toxicidad4,5. Para investigar el rendimiento y la seguridad de los nanomateriales, necesitamos comprender su ciclo de vida, que consiste en encuentro y reconocimiento – internalización – tráfico – distribución – y salida a través de diversos experimentos biológicos. La absorción de nanopartículas es un proceso amplio que incluye encuentro, reconocimiento e internalización6. Dependiendo del uso, es necesario modular el nivel de absorción para aumentar la entrega o para evitar una absorción indiscriminada. Por ejemplo, en aplicaciones médicas, si bien se debe evitar la eliminación de nanopartículas por parte de los macrófagos7, se debe mejorar la eficiencia de la entrega de nanopartículas a un órgano objetivo. Se ha realizado una amplia gama de estudios de absorción de nanomateriales con células de mamíferos7,8,9, procariotas10 y plantas11, por nombrar algunos. La absorción celular se rige por muchos parámetros diferentes6,12, como las propiedades físicas de las nanopartículas, incluidos el tamaño, la forma y la carga superficial, así como las condiciones experimentales, incluidos los tipos de células13 y el ciclo celular14. Incluso existe variabilidad entre células en la absorción de nanopartículas, como lo revela un sofisticado experimento realizado por Åberg et al.15.

Se han empleado numerosos análisis para cuantificar la absorción de nanomateriales16. Las más utilizadas son las técnicas basadas en microscopía electrónica17,18,19 o óptica20,21. También se han empleado mediciones de propiedades ópticas como la dispersión y la fluorescencia para la cuantificación con citómetros de flujo8,10,14 y lectores de microplacas19,22,23,24,25,26,27. Las técnicas basadas en plasma acoplado inductivamente (ICP), como la espectrometría de masas ICP28 y la espectroscopia de emisión atómica ICP26,29 son otra herramienta útil para cuantificar nanopartículas en células, pero son destructivas y solo aplicables a partículas metálicas. También se han adoptado otras técnicas, como la microscopía de transmisión de rayos X, la tomografía de células completas y las imágenes hiperespectrales, pero sus aplicaciones son limitadas. Aunque existen varias técnicas para la cuantificación de nanopartículas en células y tejidos, todavía se demandan técnicas más fiables, reproducibles e intercomparables, que también se utilizan habitualmente30.

Los lectores de placas se encuentran en una amplia variedad de aplicaciones de medición, que van desde tan pequeñas como iones metálicos31 hasta tan grandes como células esferoides. Sus capacidades multimodales y de alto rendimiento han facilitado el desarrollo de diversos análisis celulares que incluyen proliferación, muerte, actividad enzimática y otros ensayos fenotípicos. La combinación con avances recientes en sistemas de control ambiental y manejo de líquidos ha permitido análisis dinámicos más sofisticados. Por encima de todo, los lectores de placas son equipos fáciles de utilizar que no requieren grandes habilidades y que pueden utilizarse de diversas formas.

Entre las propiedades ópticas comúnmente medidas, la fluorescencia se usa a menudo en ensayos biológicos porque permite el análisis de moléculas biológicas incluso en concentraciones bajas y también proporciona múltiples opciones para seleccionar moléculas fluorescentes particulares dependiendo de sus longitudes de onda. Las moléculas fluorescentes conjugadas con nanopartículas sirven como reporteros para investigar la ubicación y funciones de las partículas. En nuestro trabajo anterior32, desarrollamos un ensayo de absorción de nanopartículas mediante citometría de flujo, con el que cuantificamos el nivel de absorción de nanopartículas de sílice marcadas con fluorescencia midiendo la intensidad de fluorescencia de una población celular. En este ensayo, la intensidad se puede calibrar a moléculas de fluoróforo soluble equivalente para una comparación entre diferentes conjuntos de experimentos.

Se han empleado lectores de placas para cuantificar la absorción celular de diversas nanopartículas, como poliestireno9,23, plata19, quitosano24, sílice25 y puntos cuánticos26. Para la cuantificación, a menudo se encontraron la cantidad de nanopartículas por número de células9,23 o la cantidad de proteína24,25 y la absorción relativa a las muestras de control19,26. La mayoría de los ensayos utilizaron células lisadas en lugar de células lavadas, lo que dificulta el análisis posterior. Estos trabajos publicados muestran que el lector de microplacas es una herramienta útil para los ensayos de absorción de nanopartículas, pero en muchos casos faltan investigaciones sobre los detalles experimentales y la confiabilidad de los métodos.

En el trabajo actual, nos centramos en desarrollar un ensayo de absorción de nanopartículas robusto y confiable pero de fácil acceso sin lisis celular utilizando un lector de placas. Para este propósito, primero anticipamos problemas potenciales que pueden aparecer en el procedimiento experimental y luego diseñamos específicamente el ensayo para abordar dichos problemas. Luego implementamos el método con una línea celular de linfocitos humanos, Jurkat, y nanopartículas de poliestireno marcadas con fluorescencia, y lo examinamos con nuestro ensayo previamente desarrollado basado en un citómetro de flujo. Finalmente, aplicamos el ensayo a una línea celular adherente, A549, así como a otra línea celular en suspensión, RPMI8226, para su posterior validación.

En este trabajo, nuestro objetivo fue desarrollar un ensayo confiable, robusto y también de fácil acceso para cuantificar la absorción de nanopartículas fluorescentes en células de mamíferos utilizando un lector de placas. Para ello, primero intentamos identificar los factores clave que afectarían los valores de lectura e investigarlos para lograr una medición confiable. La Figura 1 resume el procedimiento experimental del ensayo desarrollado. El ensayo consta en gran medida de tres pasos: (1) cultivar células y tratarlas con nanopartículas fluorescentes en una placa de 6 pocillos, (2) lavar las células tratadas con nanopartículas y dividir en alícuotas la solución celular lavada en una placa de 96 pocillos, y (3 ) leer la intensidad de fluorescencia de la solución celular utilizando un lector de placas y analizar los resultados.

Procedimiento experimental general para el análisis de la absorción de nanopartículas, incluida la siembra de células, el tratamiento con nanopartículas, la recolección y el lavado de células y la lectura y el análisis de placas.

El primero que identificamos que afecta la confiabilidad de los resultados de la medición es la diferencia entre el número de células entre las muestras biológicas y técnicas por triplicado en la placa de 96 pocillos que surge en gran medida del manejo de las células. El segundo es la posible presencia de nanopartículas en la solución celular por un lavado insuficiente. Las nanopartículas residuales provocan un sesgo en la intensidad de fluorescencia medida que se consideraría directamente como el nivel de absorción de nanopartículas. El tercer factor significativo es la pérdida de la señal de fluorescencia de las células tratadas con nanopartículas debido a la salida de nanopartículas cuando el medio de cultivo celular que contiene las nanopartículas se reemplaza con un tampón de lavado. Para resolver estos problemas y, por lo tanto, hacer que el ensayo sea más sólido, ideamos una solución razonable para cada uno que se presentará en detalle en las siguientes secciones. Con nuestro ensayo desarrollado, lo aplicamos a tres líneas celulares de mamíferos: dos líneas celulares sanguíneas, Jurkat y RPMI8226, y una línea celular pulmonar, A549. Primero presentaremos los resultados experimentales de las células Jurkat, que se utilizaron principalmente para desarrollar el ensayo, y luego los resultados de las células A549 y RPMI8226.

Como nanopartícula modelo, elegimos nanopartículas de poliestireno teñidas internamente de 50 nm, PSNP50. Su tamaño nominal y diámetro z promedio en medios de cultivo basales y completos medidos por dispersión dinámica de luz (DLS) fueron 50, 46,23 y 83,63 nm, respectivamente (datos complementarios, Fig. S1). El diámetro promedio determinado por microscopía electrónica de transmisión de barrido (STEM) fue de 40,07 nm. La diferencia en el tamaño de las partículas medidas por DLS y EM, aproximadamente 6 nm, se debe a la amplia distribución del tamaño de las partículas. Como se muestra en la imagen STEM y en el gráfico de distribución de tamaños, estaba presente una cantidad significativa de nanopartículas (aproximadamente 10%) de menos de 30 nm. El potencial zeta de las nanopartículas se midió como − 47,30 mV y − 13,50 mV en medios de cultivo basales y completos, respectivamente.

La intensidad de fluorescencia (FI) de PSNP50 se analizó mediante microscopía de reflexión interna total (TIRF). El FI y su distribución se compararon con los de nanopartículas de sílice (SiO2NP) marcadas con FITC sintetizadas internamente de diferentes tamaños que se sintetizaron como se describió anteriormente32. El FI promedio de los PSNP fue menor que el de los SiO2NP de tamaño similar; sin embargo, el FI de los PSNP mostró una distribución más estrecha en comparación con los SiO2NP, lo que sugiere que los PSNP son adecuados para el análisis cuantitativo de la absorción de nanopartículas (datos complementarios, Fig. S2).

En nuestro ensayo, medimos la intensidad de fluorescencia integrada de un conjunto de células en el pozo y, a su vez, la intensidad se evalúa como el nivel de absorción de nanopartículas. Lo ideal es sembrar el mismo número de células en cada pocillo y realizar el mismo manejo de muestra para cada pocillo; sin embargo, en realidad, el número de células entre los pocillos de una placa de 96 pocillos para la lectura de la intensidad de la fluorescencia puede variar. Las fuentes de variación incluyen el pipeteo y la eficiencia de recuperación en la centrifugación, que son pasos esenciales en la recolección y el lavado de células. Si el número de células entre diferentes pocillos varía demasiado, el ensayo de absorción resultante no será fiable. Por lo tanto, es deseable normalizar la intensidad de la fluorescencia con el número de células en el paso de análisis. Si bien el recuento de células con dispositivos de conteo puede ser la mejor opción, contar células en varias decenas de muestras requiere mucho tiempo y no es fácil de lograr. Además, es posible que el número de células en los pocillos individuales no sea lo suficientemente alto para que la mayoría de los contadores de células proporcionen una medición confiable. Otros ensayos colorimétricos basados ​​en microplacas de alto rendimiento para la estimación del número de células, como los ensayos MTT, no son compatibles con nuestro ensayo debido a la interferencia de las nanopartículas fluorescentes. Por lo tanto, en este trabajo, utilizamos la densidad óptica (DO) de la solución celular como sustituto de la concentración celular para normalizar la intensidad de la fluorescencia.

Si bien la medición de la DO se ha utilizado habitualmente para controlar el crecimiento de células bacterianas33, rara vez se ha empleado en cultivos de células de mamíferos34,35. En cambio, los estudios relacionados aplican de forma rutinaria el recuento celular directo utilizando un hemocitómetro o un contador celular automático, o métodos de recuento celular indirecto que miden las actividades metabólicas de las células o la cantidad de ADN de los sedimentos celulares. Las mediciones de OD se han visto limitadas principalmente por los numerosos componentes del medio de cultivo que afectan las propiedades ópticas de la solución celular. Sin embargo, en nuestro ensayo, el medio de cultivo se elimina casi por completo durante el paso de lavado y las células se resuspenden en 1 × PBS, lo que nos permite esperar que la DO estará altamente correlacionada con la concentración celular.

Primero, verificamos si las nanopartículas pueden afectar la DO de la solución celular. La presencia de nanopartículas inferiores a 10 µg/ml no contribuye a la DO independientemente de la longitud de onda. En el caso de 100 µg/mL, la densidad óptica de las nanopartículas no fue despreciable y más pronunciada en longitudes de onda más cortas debido al tinte verde incrustado en las nanopartículas (datos complementarios, Fig. S3). Luego obtuvimos un gráfico entre el número de celda y la DO para ver la correlación. Se prepararon diluciones en serie de células Jurkat que oscilaron entre 0,59 y 9,3 × 105 células por pocillo en una placa de 96 pocillos, y las DO se midieron en varias longitudes de onda que oscilaron entre 400 y 650 nm con intervalos de 50 nm. Para un recuento celular preciso, utilizamos cuentas de recuento y citometría de flujo en lugar de un contador de células automático. La estrategia de activación se resume en los datos complementarios de la figura S4 (A). La gráfica entre el número de células y la DO muestra una relación bastante lineal a 600 nm con valores de R2 superiores a 0,99, como se muestra en la Fig. 2A. La medición fue reproducible y las pendientes de dos experimentos separados (círculos grises y negros en la Fig. 2A) fueron casi idénticas. Se obtuvieron resultados similares para las DO obtenidas en otras longitudes de onda. En conjunto, podemos concluir que la OD se puede utilizar como parámetro sustituto del número de células para la normalización de la intensidad de fluorescencia, compensando así las desviaciones en el número de células entre pocillos. En todas las longitudes de onda probadas de 400 a 650 nm, el efecto de las nanopartículas sobre la OD no fue significativo en el rango medido, y la linealidad de la concentración celular y la OD fue suficientemente buena (Datos complementarios, Fig. S5). Por lo tanto, en experimentos posteriores, se seleccionó para el análisis 600 nm, que se ve menos afectado por el tinte verde utilizado en este trabajo que las longitudes de onda más cortas y que se usa comúnmente para medir la concentración de células microbianas. Se pueden seleccionar longitudes de onda más cortas para la normalización para evitar posibles interferencias de las moléculas de tinte, cuando se utilizan nanopartículas que contienen tintes de longitudes de onda más largas.

(A) Correlación entre el número de células y la densidad óptica medida a 600 nm y (B) Cambio de intensidad de FITC mediante lavado repetido de células Jurkat.

Como se explica en la sección de diseño experimental, las nanopartículas residuales en la solución celular pueden afectar la lectura de fluorescencia mediante un lector de placas. Múltiples lavados de la solución celular aseguran la eliminación completa de las nanopartículas; sin embargo, pueden ocurrir efectos adversos por la exposición prolongada de las células a ambientes libres de suero y nutrientes y el posible flujo de nanopartículas de las células al tampón de lavado. Por lo tanto, en lugar de lavados de pequeño volumen, utilizamos un gran volumen de tampón de lavado, es decir, 5 ml por lavado, para las células de un pocillo de una placa de 6 pocillos que contiene aproximadamente 5 × 105 células. Luego, para optimizar el número de lavados, las células lavadas un número diferente de veces se sometieron a mediciones de fluorescencia utilizando un citómetro de flujo. Para las células lavadas dos veces, se observó una gran disminución en la señal de FITC en comparación con la de después de un lavado, pero no se observó una disminución notable en la señal de FITC después de un tercer lavado (Fig. 2B). Entonces, llegamos a la conclusión de que dos lavados fueron suficientes para eliminar las nanopartículas del medio de cultivo y, en consecuencia, brindar resultados confiables en el lector de placas. Además, observamos una disminución gradual en la intensidad de FITC cuando las células se dejaron en 1 × PBS a temperatura ambiente, posiblemente debido al flujo de salida de nanopartículas de las células al tampón. Se ha informado que la absorción de nanopartículas depende de la temperatura, donde 4 °C solo permite la unión de las nanopartículas a la membrana celular e inhibe la internalización36. Por lo tanto, la manipulación de la muestra se realizó en hielo tanto como fuera posible para evitar la pérdida de señal de fluorescencia.

Las células Jurkat en una placa de 6 pocillos se trataron con nanopartículas que oscilaban entre 5 y 100 µg/ml (5, 12,5, 25, 50 y 100) durante 24 h. Primero, investigamos si la presencia de nanopartículas afecta la morfología, la viabilidad o la proliferación celular. Como se muestra en la Fig. S6, la morfología celular se comprobó bajo un microscopio y no se observaron cambios notables. Se mantuvo una alta viabilidad celular y se midió que el número de células tratadas con diferentes concentraciones de nanopartículas era similar independientemente del tratamiento con nanopartículas. Después del tratamiento, preparamos muestras biológicas y técnicas por triplicado en una placa de 96 pocillos como se describe en el esquema experimental (Fig. 1). Nuestro diseño de muestra en la placa de 96 pocillos para lectura de placas se presenta en la Fig. S7.

Como se muestra en la Fig. 3A, la intensidad FITC de la solución de células Jurkat, medida con un lector de placas, aumentó al aumentar la concentración de nanopartículas tratadas. Aunque las tres réplicas biológicas mostraron tendencias similares, hubo variación entre ellas y el CV fue de hasta 9,41 % para la muestra de 50 µg/ml. Normalizamos la intensidad de FITC al valor de OD del mismo pozo medido a 600 nm (Fig. 3B). Después de la normalización, la variación entre las tres muestras replicadas se redujo significativamente, como se muestra en la Fig. 3C, donde el CV disminuyó al 3,63 % para la muestra de 50 µg/ml. Se observó una disminución en CV en todas las concentraciones de nanopartículas, y fue particularmente evidente en las muestras de mayor concentración. Los datos brutos y analizados correspondientes para este conjunto de experimentos se resumen en la Tabla de datos complementarios S1. Para una validación cruzada, también realizamos el ensayo de absorción de nanopartículas basado en citómetro de flujo desarrollado en nuestro trabajo anterior32. Se seleccionaron células Jurkat individuales vivas de acuerdo con la estrategia descrita en los datos complementarios de la Fig. S4 (B), y se trazó la intensidad mediana de FITC. Como se muestra en la Fig. 3D, la medición del citómetro de flujo mostró una tendencia muy similar a la medición del lector de placas. Teniendo en cuenta que el ensayo basado en citómetro de flujo mide la intensidad de FITC de células individuales, podemos confirmar indirectamente que la normalización de los valores de FITC utilizando OD corrige las diferencias en el número de células.

Cuantificación de la absorción de nanopartículas por células Jurkat para réplicas biológicas. Los diagramas de dispersión muestran tres réplicas biológicas de células Jurkat tratadas con diferentes concentraciones de PSNP50. (A) Intensidad de FITC medida por un lector de placas, (B) densidad óptica medida a 600 nm por un lector de placas, (C) intensidad de FITC normalizada por la densidad óptica y (D) intensidad de FITC medida por un citómetro de flujo.

Luego investigamos la cinética de absorción de las células Jurkat. Mostraron una absorción inmediata de PSNP tras la exposición a nanopartículas. La intensidad de FITC normalizada de las células que fueron expuestas a nanopartículas durante 2 h fue el 70% de la medida en las células tratadas durante 24 h (datos complementarios, Fig. S9). En nuestro trabajo anterior, observamos de manera similar que las células THP-1, un monocito en cultivo en suspensión, mostraron una absorción inmediata de nanopartículas de sílice, mientras que las células de tipo adherente (A549, HCC827 y HaCaT) mostraron un aumento lineal constante de la absorción de nanopartículas para 24h32. Además, anteriormente se informó una absorción instantánea similar de nanopartículas de poliisopreno por parte de las células Jurkat37.

Para validar aún más el ensayo, se realizaron y compararon tres conjuntos independientes de experimentos en días diferentes. Aunque seguimos el mismo protocolo para cada ensayo, las mediciones de FITC en uno de los experimentos (Experimento 1) fueron diferentes de los demás, como se muestra en la Fig. 4A. Es probable que los datos de medición fluctúen debido a diversos factores, como diferencias en el número de células causadas por diferencias en la proliferación según el número de pases o la densidad de siembra celular inicial, y diferencias en la pérdida de células durante la recolección y el lavado de células. Si las fluctuaciones se deben a diferencias en el número de células, se pueden corregir normalizando la intensidad de FITC a OD. De hecho, la normalización mejoró significativamente el nivel de acuerdo entre experimentos como se presenta en la Fig. 4B; El cambio de CV por normalización se muestra en la Fig. S10.

Cuantificación de la absorción de nanopartículas por células Jurkat en múltiples experimentos. Los diagramas de dispersión muestran tres conjuntos diferentes de experimentos con células Jurkat tratadas con diferentes concentraciones de PSNP50. (A) Antes y (B) después de la normalización de la intensidad de FITC con absorbancia a 600 nm.

La correlación entre la concentración de nanopartículas y la intensidad de la fluorescencia fue alta, especialmente en el rango de concentración baja, como se muestra en la Fig. S11. Usando la relación lineal, podemos calcular la concentración mínima de PSNP50 requerida para la cuantificación de la absorción. En nuestra configuración experimental, se pudieron detectar células A549 tratadas con tan solo 1 µg/ml de PSNP50, según la intensidad de fluorescencia de fondo del control negativo no tratado.

Para investigar la versatilidad del ensayo desarrollado, probamos otros dos tipos de células. Una es la línea celular adherente A549, una célula de carcinoma de pulmón humano, y la otra es una segunda línea celular en suspensión, RPMI8226, un linfocito B humano. Primero, para ambas líneas celulares, se investigó la correlación entre el número de células y la DO, y los resultados se presentan en las figuras 5A y B. Para las células A549, se realizaron dos experimentos separados con números de células que oscilaban entre 0,42 y 7,4 × 105 células por pocillo en una placa de 96 pocillos mostró una buena correlación entre el número de células y la DO. Asimismo, las células RPMI8226 que oscilaban entre 0,4 y 7,5 × 105 células por pocillo en una placa de 96 pocillos también mostraron una buena correlación lineal entre el número de células y la DO. Las tres líneas celulares mostraron una relación lineal entre el número de células y la DO, pero con diferentes coeficientes (es decir, pendientes). La contribución de las células a la intensidad de la señal de OD fue mayor en A549 y menor en las células Jurkat (datos complementarios, Fig. S12 (A)). La densidad óptica de las células depende de su tamaño y complejidad. Por lo tanto, analizamos los parámetros de dispersión obtenidos de un citómetro de flujo, a saber, la dispersión directa (FSC) y la dispersión lateral (SSC), que reflejan el tamaño y la complejidad de un objeto, respectivamente. Como se muestra en los datos complementarios Fig. S12 (B) y S12 (C), ambos parámetros fueron los más altos en A549 y los más bajos en Jurkat, y estos resultados explican la variación en la pendiente de la correlación entre el número de células y la DO entre las líneas celulares. .

Gráficos de dispersión que muestran la correlación entre el número de células y la densidad óptica medida a 600 nm para las células (A) A549 y (B) RPMI8226. Resultados de la captación de FITC-PSNP50 de diferentes conjuntos de experimentos con células (C) A549 y (D) RPMI8226.

Luego investigamos si el tratamiento con nanopartículas afecta la morfología celular y la proliferación de las células A549 y RPMI8226, como observamos en las células Jurkat. Con respecto a la morfología celular, no se produjeron cambios notables en ninguna de las líneas celulares de todas las nanopartículas tratadas (Fig. S13 (A) y S13 (B)). Para las células A549, la proliferación celular se midió mediante imágenes en vivo seguidas de un análisis de recuento celular. Las células tratadas con nanopartículas mostraron un patrón de crecimiento similar independientemente de la concentración de nanopartículas, lo que demuestra que la presencia de nanopartículas de hasta 100 µM no afectó la proliferación celular (Fig. S13 (C)). El cultivo prolongado durante 72 h tampoco mostró cambios significativos dependientes de la concentración de nanopartículas en el crecimiento celular (Fig. S13 (D)). Para las células RPMI8226, el número de células que se estimó con precisión mediante un citómetro de flujo utilizando perlas de conteo se mantuvo a un nivel constante independientemente de la concentración de nanopartículas tratadas (Fig. S13 (E)).

Luego se analizó la absorción de nanopartículas para ambas líneas celulares utilizando el ensayo desarrollado. Pudimos observar resultados similares de absorción dependiente de la concentración de nanopartículas en ambas líneas celulares, similares a los observados en las células Jurkat. RPMI8226 mostró resultados más similares a las células Jurkat, exhibiendo un aumento bastante lineal de la intensidad de FITC hasta 25 µg/mL seguido de un aumento ligeramente retardado en concentraciones más altas, mientras que las células A549 mostraron un aumento bastante lineal y consistente en la intensidad de FITC con una concentración creciente de nanopartículas tratadas, como se muestra en las figuras 5C y D. Podríamos reconfirmar que la normalización utilizando la OD redujo la desviación entre las réplicas biológicas de las células al comparar los diagramas de dispersión antes y después de la normalización, y también mediante los resultados del citómetro de flujo, como se presenta en datos complementarios Fig. S14 y S15.

Para muestras tratadas con concentraciones de nanopartículas más bajas, la normalización por OD no necesariamente mejoró los valores de CV. Dado que cada pocillo de la placa de 96 pocillos contiene un número similar de células, la DO de cada pocillo (es decir, el denominador de la normalización) permanece constante independientemente de la concentración de nanopartículas tratadas, mientras que la intensidad de la fluorescencia depende en gran medida de la concentración. Para muestras tratadas con nanopartículas de 5 µg/ml, la intensidad de fluorescencia es muy baja, cercana al nivel de fondo, lo que puede provocar fluctuaciones en los valores normalizados. Sin embargo, para muestras con una intensidad de FITC superior al nivel de fondo (en nuestro ensayo, células tratadas con concentraciones de nanopartículas de 10 µg/ml o superiores) se confirmó que el CV se podía reducir significativamente y se podía mejorar la confiabilidad de la medición. .

Por último, consideramos el caso de utilizar una única placa de 96 pocillos para todo el ensayo, es decir, eliminar los pasos de recolección y transferencia. Si utilizamos las células adheridas tal cual sin transferencia para la lectura de fluorescencia, se eliminan las fluctuaciones de medición causadas por la transferencia de la solución celular de la placa de 6 pocillos a la placa de 96 pocillos y el lavado de las células mediante centrifugación. Siempre que el lavado de las células adherentes en los pocillos elimine eficazmente las nanopartículas y la señal de fluorescencia sea lo suficientemente alta como para cuantificar el nivel de absorción, esperamos que los resultados de la medición de este formato también sean confiables. Para ello, investigamos si los resultados de la medición del ensayo desarrollado son comparables al caso en el que tanto el cultivo celular como la lectura de fluorescencia se realizan en la misma placa de pocillos para células adherentes.

En este formato, las células A549 adherentes se cultivaron primero en una placa de 96 pocillos, se trataron con nanopartículas y luego se lavaron cuidadosamente. La fluorescencia se midió con un lector de placas. Pudimos observar un aumento lineal dependiente de la dosis de nanopartículas en la intensidad de FITC de las células A549 tratadas, una tendencia muy similar a los resultados observados con las células A549 en suspensión (Fig. S16 (A)). Sin embargo, en este formato hubo dificultades técnicas en el paso de lavado para eliminar las nanopartículas residuales. Necesitamos lavar las células suavemente pipeteando para evitar que las células se desprendan; sin embargo, incluso con un lavado cuidadoso, algunas células comenzaron a caerse después del segundo lavado. La intensidad de la fluorescencia disminuyó después del segundo lavado (Fig. S16 (B)), pero fue difícil determinar la causa entre la eliminación de nanopartículas residuales, el inevitable desprendimiento de una pequeña cantidad de células durante el lavado y el eflujo de nanopartículas de células durante el lavado porque no se pudieron realizar más lavados debido a la pérdida de células. Aunque pudimos demostrar que, para las células adherentes, el ensayo de absorción de nanopartículas puede realizarse con una sola placa de 96 pocillos tanto para el cultivo celular como para la medición de la fluorescencia, se requiere una mayor optimización y validación para un ensayo confiable.

En este trabajo, desarrollamos un ensayo de absorción de nanopartículas marcadas fluorescentemente basado en microplacas que se puede utilizar tanto para células en suspensión como para células adherentes, y lo aplicamos con éxito a tres líneas celulares de mamíferos. Durante el desarrollo, consideramos posibles factores que podrían afectar la lectura y exploramos formas de aumentar la confiabilidad del ensayo. Como resultado, la intensidad de la fluorescencia se normalizó mediante la densidad óptica que corresponde en gran medida al número de células, lo que mejoró la concordancia entre las réplicas biológicas y técnicas, y también entre múltiples conjuntos de experimentos realizados en diferentes días. Teniendo en cuenta que los resultados experimentales se ven muy afectados por el estado de las células dependiendo de los pases o las condiciones de cultivo para los ensayos basados ​​en células, normalizar los valores de medición por densidad óptica, que está directamente relacionada con el número de células, es un paso beneficioso para el ensayo desarrollado. Esto es especialmente útil porque sólo se requiere una lectura adicional de la absorción cuando se lee la fluorescencia sin procedimientos experimentales adicionales. Además de la normalización, se optimizó el número de lavados y la temperatura de manipulación de las muestras para proporcionar resultados confiables. Una optimización adicional, como el uso de medio de cultivo celular libre de rojo fenol para reducir los efectos adversos de mantener las células en 1 × PBS durante un tiempo prolongado y una calibración sofisticada de la densidad óptica33, puede mejorar la confiabilidad del ensayo. Nuestro ensayo mide señales integradas de un conjunto de células en lugar de investigar células individuales y, por lo tanto, no puede proporcionar información detallada sobre la absorción celular de nanopartículas a diferencia de otras técnicas como la microscopía. En cambio, tiene la ventaja de poder evaluar rápida y simultáneamente la absorción de nanopartículas de múltiples muestras en diversas condiciones con una configuración de fácil acceso que consiste en cultivo celular de rutina y lectura de placas. Por lo tanto, puede servir como una herramienta útil para complementar los sofisticados y precisos ensayos de absorción de nanopartículas existentes.

Las células Jurkat, A549 y RPMI8226 se mantuvieron en medio Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 suplementado con suero bovino fetal al 10 %, 200 unidades por ml de penicilina y 200 unidades por ml de estreptomicina, y se incubaron a 37 °C en un ambiente humidificado a 5 % CO2 atmósfera. Todas las líneas celulares se obtuvieron de ATCC (American Type Culture Collection). Se obtuvieron imágenes de contraste de fases de las células utilizando un microscopio invertido (Olympus IX71). Todos los suministros de cultivo se obtuvieron de Thermo Fisher Scientific a menos que se indique lo contrario. El recuento celular y el ensayo de viabilidad se realizaron con un Countess II FL utilizando el método de exclusión de azul tripano (Thermo Fisher Scientific).

Para las células en suspensión, Jurkat y RPMI8226, las células se mantuvieron sin exceder de 1 a 2 × 106 células / ml y evitando la acidificación del medio, y se preparó una cantidad adecuada de células antes del tratamiento con nanopartículas. Para las células adherentes, A549, las células se sembraron en placas de 6 pocillos a una densidad de 2 a 3 x 105 células por pocillo. Al día siguiente, el medio de cultivo se reemplazó con medio nuevo y se usó para el tratamiento con nanopartículas. Para un experimento con placa de 96 pocillos, se sembraron células A549 en una placa de 96 pocillos a una densidad de 6 a 8 x 104 células por pocillo. Al día siguiente, el medio de cultivo se reemplazó con medio nuevo y se usó para el tratamiento con nanopartículas.

Para las células en suspensión, se sembraron de 4 a 5 x 105 células por pocillo en una placa de 6 pocillos y luego se sembró un volumen apropiado de 10 x nanopartículas de poliestireno teñidas de verde de 50 nm concentradas (partícula fluorescente acuosa teñida de verde Fluoro-Max, excitación y emisión). picos de 468 y 508 nm, Thermo Fisher Scientific) preparado en medio de cultivo y se mezcló mediante pipeteo. Para las células de adhesión, se añadió un volumen apropiado de 10 x nanopartículas de poliestireno teñidas de verde concentradas de 50 nm preparadas en medio de cultivo y se mezcló agitando suavemente a mano. Para un ensayo de rutina, después de 24 h, las células se recolectaron y se lavaron dos veces con un volumen suficiente de solución salina tamponada con fosfato (PBS) 1x para eliminar las nanopartículas residuales tanto en los medios de cultivo como en las superficies celulares. Las células de cada pocillo se resuspendieron en 0,6 ml de 1 x PBS y se mantuvieron a 4 ° C antes de análisis adicionales. Para un ensayo cinético, las células se recogieron a las 2, 4, 6 y 24 h y se prepararon para los análisis. Para el experimento de placa de 96 pocillos con células A549, las células se lavaron suavemente dos veces con 300 µl de 1 x PBS evitando el desprendimiento de las células y luego se agregaron 180 µl de 1 x PBS.

Para la prueba de lavado, se prepararon células Jurkat en una placa de cultivo de 100 mm a una densidad de 3 a 4 x 106 células por 10 ml de medio de cultivo que contenía nanopartículas de 100 µg/ml. Después de 24 h, las células se recogieron y se lavaron un número diferente de veces con un volumen suficiente de 1 x PBS, y luego se resuspendieron en 1 x PBS y se mantuvieron a 400°C antes de análisis adicionales.

Las células tratadas con nanopartículas se repartieron en alícuotas de 180 µl cada una en tres pocillos de una placa de 96 pocillos de paredes negras (Corning). La medición se llevó a cabo inmediatamente después de la alícuota utilizando un lector de microplacas Synergy HTX (BioTek). La placa se agitó durante 2 s antes de la medición. La fluorescencia se midió desde abajo con picos de excitación y emisión de 485 y 528 nm. La absorbancia se midió de 400 a 650 nm a intervalos de 50 nm. La configuración de adquisición, incluida la ganancia, siguió siendo la misma para todos los experimentos.

Las células se analizaron utilizando un FACSVerse (BD Biosciences). Para el análisis de la absorción de nanopartículas, la población unicelular viva se clasificó en un gráfico de dispersión directa versus dispersión lateral después de excluir los restos celulares y los dobletes, y se utilizó su histograma FITC para el análisis. Para el recuento de células, se utilizaron tubos TruCount o perlas de recuento de líquidos (BD Biosciences). Para el primero, se agregaron 300 µl de solución celular diluida a los tubos, y para el segundo, se mezclaron 250 µl de solución celular diluida y 50 µl de solución de perlas antes de la medición. Las células se diluyeron adecuadamente para no dominar el evento de adquisición. La configuración de adquisición, incluido el voltaje de cada canal, permaneció igual para todos los experimentos. Para el análisis, las poblaciones de cuentas y sin cuentas se clasificaron en una gráfica de fluorescencia (p. ej., FITC o PerCP-Cy5.5) versus dispersión lateral, y luego, de la población sin cuentas, se seleccionó la población de células excluyendo los desechos en un gráfico de dispersión frontal versus dispersión lateral. Todos los datos se analizaron utilizando FlowJo (versión 10.8, FlowJo LLC).

Se sembraron células A549 en placas de 35 mm de fondo transparente (ibidi) a una densidad de 2 x 105 por pocillo y se controlaron durante 72 h utilizando un microscopio automatizado Lionheart FX (Biotek). Las imágenes se tomaron cada 2 h. Se recogieron imágenes de 16 campos de visión por plato y se analizaron juntas.

El tamaño hidrodinámico y el potencial zeta de las nanopartículas se determinaron utilizando un Zetasizer Nano ZSP (Malvern Panalytical). Los resultados se informan como el promedio de tres ejecuciones. Las imágenes de microscopía electrónica de transmisión de barrido (STEM) se obtuvieron con un detector STEM anular (aSTEM) utilizando microscopía electrónica de barrido (ZEISS GeminiSEM 500). El análisis del diámetro de las partículas se realizó con ImageJ utilizando el umbral de Otsu. Sólo se seleccionaron y midieron nanopartículas separadas de forma independiente, y para la medición se analizaron un total de 360 ​​nanopartículas.

El FI de las nanopartículas se midió con un microscopio TIRF de fabricación casera. Se utilizó un haz de 488 nm para excitar nanopartículas inmovilizadas en la superficie mediante unión no específica. La fluorescencia de las muestras se recopiló a través de una lente objetivo (UPLSAPO 60XW, Olympus) y se tomaron imágenes con un CCD multiplicador de electrones (iXon Ultra 888, Andor Technology). Los archivos de película (de 2 a 3 s de duración) se grabaron a 100 ms por cuadro. El FI de partículas individuales se extrajo y analizó utilizando IDL (ITT Visual Information Solution) y MATLAB (MathWorks).

Todos los datos generados o analizados durante este estudio se incluyen en este artículo publicado y sus archivos de información complementarios.

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Este trabajo fue apoyado por el Programa de Desarrollo de Tecnología de Nanomateriales (No. 2016M3A7B6908929) de la Fundación Nacional de Investigación (NRF) y KRISS-GP2021-0003-09 del Instituto de Investigación de Estándares y Ciencias de Corea del Ministerio de Ciencia y TIC.

Grupo de Biometrología, División de Metrología Química y Biológica, Instituto de Investigación de Normas y Ciencias de Corea, 267 Gajeong-Ro, Yuseong-Gu, Daejeon, 34113, República de Corea

Hye Ji Shin y Ji Youn Lee

Equipo de Nanoseguridad, Instituto de Medición de Seguridad, Instituto de Investigación de Estándares y Ciencias de Corea, 267 Gajeong-Ro, Yuseong-Gu, Daejeon, 34113, República de Corea

Minjeong Kwak

Equipo de bioimagen, Instituto de Medición de Seguridad, Instituto de Investigación de Estándares y Ciencias de Corea, 267 Gajeong-Ro, Yuseong-Gu, Daejeon, 34113, República de Corea

sihwa si

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Diseño de ideas y estudios: JYL Generación y análisis de datos: HJS, MK, SJ y JYL Redacción de manuscritos: HJS, MK, SJ y JYL

Correspondencia a Ji Youn Lee.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Shin, HJ, Kwak, M., Joo, S. et al. Cuantificación de la absorción de nanopartículas fluorescentes en células de mamíferos mediante un lector de placas. Informe científico 12, 20146 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-24480-3

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Recibido: 26 de mayo de 2022

Aceptado: 16 de noviembre de 2022

Publicado: 23 de noviembre de 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-24480-3

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