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Jul 01, 2023

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Nature (2023)Cite este artículo 449 Accesos 304 Altmetric Detalles de métricas Los sitios de unión de antibióticos están ubicados en dominios importantes de enzimas esenciales y se han estudiado ampliamente en el

Naturaleza (2023)Cita este artículo

449 Accesos

304 altmétrico

Detalles de métricas

Los sitios de unión de antibióticos se encuentran en dominios importantes de enzimas esenciales y se han estudiado ampliamente en el contexto de mutaciones de resistencia; sin embargo, su estudio está limitado por la selección positiva. Utilizando ingeniería genómica multiplex1 para superar esta limitación, generamos y caracterizamos una colección de 760 mutantes de un solo residuo que abarcan todo el sitio de unión de rifampicina de la ARN polimerasa de Escherichia coli (RNAP). Al mapear genéticamente las interacciones fármaco-enzima, identificamos una hélice alfa donde las mutaciones mejoran o alteran considerablemente la unión de rifampicina. Encontramos mutaciones en esta región que prolongan la unión del antibiótico, convirtiendo la rifampicina de un fármaco bacteriostático a bactericida al inducir roturas letales del ADN. Estos últimos dependen de la replicación, lo que indica que la rifampicina mata al provocar conflictos perjudiciales de transcripción-replicación en los promotores. También identificamos mutaciones adicionales en el sitio de unión que aumentan en gran medida la velocidad de RNAP. La RNAP rápida agota los nucleótidos de la célula, altera la sensibilidad celular a diferentes antibióticos y proporciona una ventaja de crecimiento en frío. Finalmente, al mapear la diversidad de secuencias naturales de rpoB, descubrimos que las mutaciones funcionales en el sitio de unión de rifampicina que alteran las propiedades de RNAP o confieren resistencia a los medicamentos ocurren con frecuencia en la naturaleza.

Además de su importancia para combatir la resistencia clínica2,3,4, el estudio de mutantes resistentes a los antibióticos también ha avanzado nuestra comprensión de los procesos biológicos fundamentales5. Debido a que los antibióticos funcionan dirigiéndose a las enzimas necesarias para la supervivencia bacteriana, las mutaciones de resistencia han sido fundamentales en la caracterización de la maquinaria celular esencial como la ARN polimerasa6,7,8,9,10 (RNAP) y el ribosoma11,12,13,14. Se ha demostrado que las mutaciones de resistencia alteran inadvertidamente la función de los objetivos de los antibióticos, proporcionando nuevos conocimientos sobre los diversos atributos funcionales6,11,15, reguladores16 y fisiológicos12,17,18 de las enzimas esenciales, identificando los sitios de unión de los antibióticos como puntos críticos fenotípicos.

El sitio de unión de la rifampicina (Rif), un inhibidor específico de la RNAP bacteriana, está bien definido por estructuras de alta resolución8,10,19 que confirman hallazgos genéticos anteriores de mutantes resistentes20. La unión de alta afinidad de Rif impide la extensión del ARN naciente más allá de una longitud de tres nucleótidos y la unión de Rif se pierde en los mutantes resistentes. En conjunto, los mutantes de resistencia manifiestan una fascinante variedad de fenotipos que son consecuencia de cambios en las propiedades de la enzima mutante en cada paso del ciclo de transcripción15,16,21,22,23,24. Aunque Rif es conocido por su resistencia de alta frecuencia4,25,26, el espectro conocido de mutantes resistentes representa menos del 5% del espacio mutacional no redundante en esta región de la subunidad β de RNAP. Por lo tanto, nuestra comprensión funcional del sitio de unión de Rif aún está incompleta.

La ingeniería genómica automatizada múltiple (MAGE) junto con la secuenciación está libre de las limitaciones de la selección positiva y las bajas tasas de mutación27,28,29. Este sistema permite la introducción y el seguimiento de mutaciones en una región de interés del cromosoma bacteriano con una eficiencia y especificidad extremadamente altas1,30,31 y se ha utilizado anteriormente para caracterizar la optimización de codones y la diversidad de secuencias en los genes esenciales infA y rpoD27,28.

En este trabajo, generamos una colección de mutantes RNAP que abarcan todas las sustituciones posibles en cada posición del sitio de unión de Rif. Proporcionamos un mapa genético detallado de las interacciones de unión de Rif e identificamos una hélice alfa que abarca rpoB 521–526 donde las mutaciones pueden aumentar o disminuir la potencia de Rif. En esta región, descubrimos mutantes de un solo residuo que convierten a Rif de un fármaco bacteriostático a bactericida al aumentar su afinidad de unión y causar daño al ADN. Mostramos que los efectos bactericidas dependen de la replicación activa, lo que indica que la RNAP atrapada por Rif en los promotores causa conflictos perjudiciales entre transcripción y replicación. Delineamos otras mutaciones de residuo único en el sitio de unión de Rif que producen RNAP rápido y determinamos que la alta velocidad de transcripción agota los nucleótidos de la célula, aumentando la susceptibilidad a los antibióticos, pero también puede ser beneficiosa ya que proporciona una ventaja de crecimiento a temperaturas más bajas debido a una terminación deficiente. eficiencia. A pesar de la alta conservación evolutiva, identificamos mutaciones funcionales en el sitio de unión de Rif que ocurren con alta frecuencia en la naturaleza. Nuestro trabajo demuestra que el sitio de unión de Rif es un dominio multifuncional de RNAP y su caracterización amplía nuestra comprensión del potencial antibacteriano de Rif y la relación entre la velocidad de transcripción y la fisiología bacteriana.

Generamos y monitoreamos un conjunto saturado de sustituciones de aminoácidos individuales en las posiciones rpoB 510–537 y 563–572 usando MAGE junto con la secuenciación27 (Fig. 1a, b). Se ha demostrado que estas posiciones interactúan con Rif estructural o genéticamente8,10 y abarcan mutantes de resistencia que se encuentran más comúnmente en aislados clínicos9. Después de un ciclo de MAGE, preparamos bibliotecas de secuenciación para estimar la eficiencia de la recombinación de oligo y recuperamos la mayoría de las sustituciones esperadas con una frecuencia entre 10-3 y 10-5 (Fig. 1c y Datos extendidos Fig. 1a). Pudimos detectar de manera reproducible más del 99% de los mutantes generados antes de la selección, lo cual es fundamental en nuestro diseño experimental para la identificación de mutantes sensibles (Fig. 1d).

a, El sitio de unión de Rif dentro de la subunidad rpoB de RNAP de E. coli (en azul), ampliado en el panel inferior (PDB 5UAC). b, Diagrama esquemático de la generación del grupo de mutantes. Los oligos MAGE se diseñaron para generar un conjunto saturado de 760 mutantes de un solo codón (20 sustituciones x 38 posiciones) dentro del sitio de unión de Rif. c, Mapa de calor representativo de abundancias de mutantes generados con MAGE en el momento 0 (T0) y en el momento 1 (T1), después de la evaluación de aptitud. Para el análisis de los datos de detección, se realizó la normalización entre T1 y T0 calculando el cambio en veces log2 (aptitud T1/T0). Las filas corresponden con las posiciones rpoB 510–537 y 563–572; las columnas corresponden a aminoácidos. Los cuadrados blancos indican residuos de tipo salvaje. d, Esquema de la prueba de sensibilidad y resistencia a los medicamentos. Los mutantes que no crecen en LB se denominan mutantes débiles, mientras que los mutantes que sólo no crecen en el fármaco se consideran sensibles al fármaco. Los efectos específicos de los fármacos se pueden aislar normalizando las abundancias de mutantes del 'fármaco T1' a la 'aptitud T1', es decir, log2 (fármaco T1/aptitud T1).

Datos fuente

Para distinguir los mutantes sensibles a los medicamentos de los inviables, comenzamos monitoreando la aptitud de los mutantes en condiciones de crecimiento regulares. Preparamos muestras de células en cultivo líquido después de dos diluciones posteriores de 100 veces, lo que permitió que las células alcanzaran la misma densidad óptica (OD) antes de la recolección (Datos ampliados, figura 1a). También preparamos muestras después de pasar el conjunto de mutantes en placas de agar (Datos ampliados, figuras 1a y 2c, d). Como se esperaba, los codones de parada se agotan rápidamente (Fig. 1c y Datos ampliados, Fig. 1a-d). También observamos que la distribución de los efectos de aptitud en esta región de rpoB es bimodal, con un pico que representa sustituciones neutrales en 0 y el otro representa sustituciones perjudiciales en -2 (Datos ampliados, figura 2b). Otros estudios sistemáticos de mutagénesis en proteínas esenciales han observado la misma distribución bimodal27,28. Cuando se utiliza 0 como umbral para mutantes inviables, el 58% de las sustituciones son inviables, lo que es comparable a valores del 53% y 48% para rpoD e infA, respectivamente27,28.

A continuación, analizamos nuestra colección de mutantes rpoB con Rif, biciclomicina (BCM) y 5-fluorouracilo (5FU) y normalizamos los datos para aislar los efectos específicos de los fármacos (Fig. 1d y Datos ampliados, Figs. 1-3). Seleccionamos BCM, un inhibidor de la terminación Rho, y 5FU, un análogo de nucleótido, porque previamente se ha demostrado que los mutantes resistentes a Rif son deficientes en la terminación Rho32 y altamente sensibles a los análogos de nucleótidos4. Curiosamente, esta región relativamente pequeña de RNAP es rica en mutaciones que proporcionan una sensibilidad diferencial hacia estos compuestos (Fig. 2a y Datos ampliados, Fig. 1). La resistencia Rif ocurre en posiciones conocidas; sin embargo, la gama de sustituciones que confieren resistencia es mucho más amplia (Figs. 2a y 3a). Observamos que algunas mutaciones, como las de la posición 531, son relativamente monótonas a pesar de que se sabe que causan resistencia al Rif10. Esto se debe a que estos mutantes generalmente crecen lentamente, como lo demuestra el examen de aptitud física, y por lo tanto son difíciles de detectar ya que son altamente resistentes en el formato de examen (Datos ampliados, figuras 1a y 2a; Métodos). La resistencia a BCM se observa en mutaciones en la región alrededor de la posición 567 (Fig. 2a, by Datos ampliados Fig. 3a, b, e, f). La resistencia a 5FU también parece ocurrir en esta región (Fig. 2a, b y Datos ampliados Fig. 3c, d, g, h).

a, Mapa de calor agregado de la aptitud y sensibilidad del mutante rpoB a Rif, BCM y 5FU. Las columnas corresponden a cada modalidad de detección y las filas representan cada posición de aminoácido. b, Estructura proteica del sitio de unión de Rif con un mapa de colores de aptitud posicional promedio o sensibilidad a Rif, BCM o 5FU. Las mutaciones de resistencia o de alta aptitud están representadas en rojo. Las puntuaciones Z se calculan para cada modalidad de detección a partir de experimentos MAGE-seq realizados en n = 3 réplicas biológicamente independientes.

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a, Paisaje de sensibilidad y resistencia de mutantes rpoB hacia Rif. Las filas corresponden con la posición rpoB y las columnas indican las 20 sustituciones de aminoácidos, agrupadas por propiedad. Los cuadrados blancos indican residuos de tipo salvaje. A la derecha del mapa de calor se proporciona un gráfico de barras del cambio de pliegue posicional promedio. b, Gráfico de datos del volcán en a. Los codones de parada están en gris. c, MIC de Rif en mutantes hipersensibles (P = 1,2 × 10−4, 2,1 × 10−3 de izquierda a derecha). d, Metanálisis de la señal ChIP-seq de RNAP de tipo salvaje (WT) y rpoB T525D alrededor de los sitios de inicio de la transcripción (TSS) de genes altamente transcritos después de 1 h de recuperación de 1 h de tratamiento con 80 µg ml-1 de Rif. e, Eficiencia de recubrimiento de mutantes hipersensibles después de 1 h de tratamiento con 80 µg ml-1 de Rif (n = 6; P = 5,7 × 10−4, 1,8 × 10−4). f, daño en el ADN medido mediante tinción con TUNEL en mutantes hipersensibles después de 1 h de tratamiento con 80 µg ml-1 de Rif. Las células TUNEL positivas son el porcentaje de células que exceden la señal detectada en más del 99% de las células no tratadas (n = 4; P = 1,3 × 10−2, 4,7 × 10−3). g, Eficiencia de siembra en placas de mutantes hipersensibles en cepas knockout recA o recBCD después de 1 h de tratamiento con 80 µg ml-1 de Rif (n = 4, P = 5,3 × 10−2, 7,3 × 10−3, 4,2 × 10−5, 5,7 × 10-5). h, Número de DSB por 10 kilobases (kb) en los promotores y sobre el cuerpo del gen medido usando SLR-qPCR después de 1 h de tratamiento con 80 µg ml-1 de Rif (P = 2,4 × 10-3, 1,7 × 10-5, 1,2 × 10−4, 3,7 × 10−3, 2,4 × 10−5, 4,2 × 10−5). i, Eficiencia de recubrimiento de mutantes hipersensibles en el fondo de PC2 que contiene un alelo sensible a la temperatura de la proteína de replicación dnaC (P = 1,8 × 10−3, 7,6 × 10−5). La replicación se bloqueó cambiando las células a 42 °C durante 1,5 h antes de un tratamiento de 30 minutos con 80 µg ml-1 de Rif. Los gráficos de barras representan la media de n = 3 experimentos biológicamente independientes a menos que se indique lo contrario, y las barras de error indican intervalos de confianza del 95%. Los valores de P se calculan utilizando la prueba t independiente (bilateral).

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Al calcular la aptitud promedio de todas las sustituciones en una posición determinada (Fig. 2b), proporcionamos una medida de la mutabilidad del residuo de tipo salvaje. Como se esperaba para una región altamente conservada de una proteína esencial, la mayoría de las posiciones son altamente inmutables y las sustituciones de R529, G566 y G570 producen los defectos de aptitud promedio más grandes (Fig. 2b y Datos ampliados, Fig. 2). Por otro lado, la hélice alfa en las posiciones 523–527 parece ser altamente mutable (Fig. 2b y Datos ampliados Fig. 2). El aumento de la aptitud posicional promedio indica que el residuo original de tipo salvaje es de alguna manera desventajoso en nuestras condiciones de crecimiento.

De manera similar, la resistencia posicional promedio hacia cada fármaco mide la importancia del residuo natural en la actividad del fármaco. Múltiples mutaciones en las posiciones 516, 526 y 572 aumentan la resistencia promedio hacia Rif (Figs. 2b y 3a), lo que indica que el residuo de tipo salvaje en esas posiciones es importante para la unión de Rif. La resistencia de alto nivel en algunas posiciones es causada por una única sustitución particular, como R529K o P564K (Fig. 3a), lo que implica que el residuo sustituido interfiere con la unión de Rif. Las mutaciones en la posición 567 aumentan la resistencia promedio hacia BCM y 5FU (Fig. 2b y Datos ampliados Fig. 3), lo que indica que la prolina original aumenta la sensibilidad hacia estos medicamentos. Por el contrario, la sensibilidad posicional promedio mide la interferencia del residuo natural con la actividad del fármaco. Por ejemplo, la treonina de tipo salvaje en 525 parece interferir con la unión de Rif, ya que muchas mutaciones en esta posición aumentan la sensibilidad (Figs. 2b y 3a). La sensibilidad o resistencia posicional proporciona una indicación de la importancia funcional y estructural de cada posición en la resolución de un solo aminoácido.

Al examinar el comportamiento de las mutaciones individuales en respuesta a Rif, nos intrigó encontrar mutantes hipersensibles a Rif (RifHS) en las posiciones 514, 521 y 525 (Fig. 3a), con sustituciones L521Y (21Y) y T525D (25D; en todas partes, mutantes de nuestra colección se abrevian a los dos últimos números de la posición y el aminoácido sustituido) produciendo el fenotipo más fuerte (Fig. 3b). Estas sustituciones no tienen ningún defecto de aptitud, lo que indica que su dilución cuando se cultiva con Rif no es un artefacto de debilidad mutante (Fig. 3b y Datos ampliados Fig. 4a). También están ubicados en una hélice alfa muy cerca de mutaciones que confieren un alto nivel de resistencia (Figs. 2b y 3a).

Los mutantes RifHS 21Y y 25D se reconstruyeron en un fondo de MG1655 de tipo salvaje para una mayor caracterización. De acuerdo con los resultados del análisis primario, las células de tipo salvaje reanudaron su crecimiento 2 h después de una alta exposición a Rif, mientras que los mutantes de RifHS tardaron más de 8 h en recuperarse (Datos ampliados, figura 4b). Estas mutaciones también dan como resultado una disminución de la concentración inhibitoria mínima (CIM) para Rif (Fig. 3c y Datos ampliados Fig. 4c).

Para probar directamente la interacción de Rif con RifHS RNAP, clonamos el mutante 21Y para expresión y purificación recombinante. En un experimento de escorrentía modificado en el que la polimerasa se satura con Rif, se lava y luego se permite que reanude la transcripción, la recuperación de 21Y es más lenta, lo que indica una unión más estrecha a Rif (Datos ampliados, figura 4d). Esto no se debe a diferencias en la actividad catalítica, ya que la velocidad de síntesis de 3 meros no cambia, siendo los 3 meros la longitud máxima del producto de una polimerasa obstruida por Rif8. Para probar si Rif hace que RifHS RNAP permanezca en los promotores in vivo, realizamos una secuenciación de inmunoprecipitación de cromatina (ChIP-seq) en RNAP después de tratar las células con Rif durante 1 h, lavar y permitir que las células se recuperen durante 1 h adicional. Después de la recuperación, se puede encontrar más ARNP de RifHS persistente en los promotores en comparación con las células de tipo salvaje (Fig. 3d y Datos ampliados Fig. 4e).

Se sabe que el Rif es bacteriostático en Escherichia coli. Para probar la destrucción celular de los mutantes RifHS, las células se trataron con Rif, se lavaron y se analizó el crecimiento de diluciones en serie en placas de agar o en caldo líquido (LB)18. En particular, aunque Rif permanece bacteriostático en células de tipo salvaje, se vuelve bactericida para ambos mutantes de RifHS en E. coli, lo que disminuye la viabilidad en al menos un orden de magnitud (Fig. 3e y Datos ampliados, Fig. 5a-d). Este efecto es específico de Rif, ya que el cloranfenicol y la tetraciclina siguen siendo bacteriostáticos (Datos ampliados, figura 5e).

Estudios anteriores informan una mayor sensibilidad de los mutantes de reparación de daños en el ADN en respuesta al tratamiento con Rif33. Para investigar los efectos bactericidas de Rif, utilizamos el marcaje de extremo de desoxinucleotidil transferasa desoxiuridina-trifosfato (dUTP) terminal (TUNEL)34 para evaluar la fragmentación del ADN después de 1 h de tratamiento con Rif. Las células de tipo salvaje exhiben una tinción TUNEL débil de alrededor del 15% de las células positivas después del tratamiento con Rif, que es más baja que cualquier antibiótico bactericida probado en trabajos anteriores35 (Fig. 3f). Ambos mutantes RifHS muestran aumentos en la tinción TUNEL con el tratamiento con Rif de hasta un 35%, similar a otros fármacos bactericidas como 5FU y norfloxacino (aproximadamente 30%)35.

Para determinar si las roturas del ADN contribuyen a los efectos bactericidas de Rif, generamos desactivaciones de las principales enzimas reparadoras de roturas de doble hebra (DSB), recA o recBCD en mutantes de RifHS. En particular, Rif se vuelve potentemente bactericida en ambos mutantes de RifHS en ausencia de reparación de DSB (Fig. 3g). Además, las células de tipo salvaje que carecen de recA se vuelven sensibles a la destrucción de Rif (Fig. 3g), lo que proporciona evidencia adicional de que Rif causa niveles bajos de daño al ADN en células de tipo salvaje (Fig. 3f). Observamos que estos efectos son específicos de Rif, ya que los mutantes de RifHS deficientes en la reparación de DSB siguen siendo insensibles a otros fármacos bacteriostáticos (Datos ampliados, figura 5f).

Como indicador secundario de daño en el ADN, medimos la expresión de genes clave en la respuesta SOS. En el tratamiento con Rif, vemos un aumento significativo en la expresión de genes implicados en la reparación de DSB (Datos ampliados, Fig. 6a). También medimos los niveles de proteína del represor del gen SOS LexA después del tratamiento con Rif y observamos que los niveles de proteína LexA disminuyen significativamente después del tratamiento con Rif, lo que indica que se escinde en respuesta al daño del ADN (Datos ampliados, Fig. 6b, c). De acuerdo con trabajos anteriores, el efecto bactericida de Rif no implica un aumento de la respiración celular ni la acumulación de especies tóxicas reactivas de oxígeno (ROS)36,37 (Datos ampliados, figuras 6d-f).

Para investigar la ubicación del daño del ADN en mutantes RifHS, utilizamos PCR cuantitativa de rango semilargo (SLR-qPCR) para detectar roturas del ADN en loci genómicos específicos (Datos ampliados, Fig. 7a) 38. Seleccionamos arbitrariamente dos genes dependientes de σ70 altamente expresados ​​en loci cromosómicos distantes y comparamos la frecuencia de DSB en promotores afines con cuerpos genéticos (Datos ampliados, figura 7b). En particular, observamos un aumento significativo en DSB en los promotores después del tratamiento con Rif tanto en mutantes de tipo salvaje como en RifHS, mientras que no se produjo ningún aumento en el cuerpo del gen respectivo (Fig. 3h). Además, los mutantes RifHS exhibieron un mayor nivel de DSB específicos del promotor que el tipo salvaje (Fig. 3h).

Trabajos anteriores han demostrado que el complejo de iniciación de la transcripción puede colisionar con el replisoma o interrumpirlo, lo que resulta en interferencia con la progresión de la horquilla de replicación o mutaciones perjudiciales39,40. Para determinar si los conflictos de replicación en los promotores están involucrados en el daño del ADN por parte de Rif, introdujimos dCas9 dirigido a oriC a las cepas RifHS para bloquear parcialmente la replicación antes del tratamiento con Rif41 (Datos ampliados, figura 7c). Descubrimos que el bloqueo de la replicación disminuye significativamente la frecuencia de DSB en los promotores (Datos extendidos, Fig. 7d, e). A continuación, construimos mutantes RifHS en células que contienen un alelo sensible a la temperatura de la proteína de replicación dnaC2 (PC2) 39,42. Verificamos que cambiar las células a la temperatura no permisiva de 42 ° C inhibe la replicación (Datos ampliados, figura 7f). Luego comparamos los efectos bactericidas de Rif con y sin replicación. En particular, observamos que Rif ya no es bactericida en mutantes RifHS cuando se inhibe la replicación (Fig. 3i). Los mutantes RifHS en el fondo de PC2 permanecen hipersensibles a la temperatura permisiva de 30 °C (Datos ampliados, figura 7g).

En resumen, demostramos que: (1) RifHS RNAP con Rif se unen de manera más persistente a los promotores; (2) el efecto bactericida de Rif en mutantes RifHS está asociado con roturas del ADN bicatenario en los promotores; (3) Rif induce la respuesta SOS; y (4) la destrucción de Rif es mucho más grave en las células que carecen de reparación de DSB. Curiosamente, la destrucción de Rif no está asociada con una acumulación de ROS, lo que indica que actúa de una manera distinta a otros antibióticos bactericidas. En cambio, observamos que los efectos bactericidas y el daño al ADN causado por Rif dependen de la replicación, lo que implica que estos efectos son el resultado de conflictos de transcripción-replicación en los promotores.

El potencial de las mutaciones en la bolsa de unión de Rif para afectar la unión de Rif es obvio, pero el mecanismo por el cual causan diferencias en la sensibilidad hacia otras drogas no es evidente. Al comparar por pares las pantallas fenotípicas, notamos correlaciones entre la aptitud, el BCM y la sensibilidad a 5FU, mientras que no existen tales correlaciones con Rif (Fig. 4a). Los mutantes de alta aptitud son extremadamente sensibles al 5FU, especialmente a las sustituciones que alteran la hélice α en las posiciones 523–527 (Fig. 2a). Además, la sensibilidad del mutante rpoB hacia BCM y 5FU está correlacionada positivamente, lo que sugiere un mecanismo subyacente común (Fig. 4a). Seleccionamos mutantes con fenotipos fuertes de cada modalidad de detección para la reconstrucción y caracterización adicional en MG1655 (Datos ampliados, figuras 1 a 3). Encontramos que la CIM de todos los mutantes rpoB reconstruidos refleja estrechamente los resultados de la detección. Los mutantes 15G, 15Y, 23P, 23W, 26V y 27W son muy sensibles al 5FU, con una disminución de aproximadamente cinco veces en la MIC (Fig. 4b); Estos mutantes también son sensibles a BCM (Fig. 4c). Los mutantes 12K, 67C, 67V y 72L muestran una alta resistencia tanto hacia BCM como hacia 5FU (Fig. 4b, c).

a, Diagramas de dispersión de la respuesta mutante de rpoB a 5FU en comparación con la aptitud o la respuesta mutante a Rif y BCM. Se superponen líneas de regresión lineal, intervalos de confianza del 95% y valores R de Pearson. Los valores de P bilaterales para las correlaciones de 5FU con los conjuntos de datos de fitness, Rif y BCM son 2,4 × 10 −43, 0,11 y 5,2 × 10 −32, respectivamente. b,c, MIC de 5FU (b) y BCM (c) para cepas sensibles o resistentes reconstruidas en MG1655 (n = 2). d, Velocidad de elongación de la transcripción de tipo salvaje y mutantes. La transcripción de cinco regiones del gen lacZ se mide después de la inducción y se representa gráficamente en función del tiempo y la distancia. La pendiente de la línea de mejor ajuste representa la velocidad de alargamiento de la transcripción. e, frecuencia de pausa media en mutantes de tipo salvaje y sensibles a 5FU medida por NETseq. Los valores indican la frecuencia de pausa media agregada por kilobase para los 3500 genes expresados ​​principales. n = 2 experimentos biológicamente independientes para cada condición (P = 1,6 × 10−3, 9,8 × 10−25, 7,2 × 10−22 de izquierda a derecha). f, Pirimidinas en mutantes sensibles a 5FU detectados por LC-MS, normalizados a UTP marcado (n = 5; P = 2,4 × 10−6, 5,6 × 10−4, 8,9 × 10−5, 6,4 × 10−5, 5,0 × 10−2, 8,4 × 10−3). g, Eficiencia del recubrimiento de mutantes sensibles a 5FU con y sin suplementación con timidina. Las células de cultivos nocturnos se diluyeron en serie y se sembraron en placas de agar LB con las concentraciones indicadas de 5FU en µg ml-1 con y sin 1 mg ml-1 de timidina (P = 3,1 x 10-3, 8,6 x 10-3, 4,7 x 10-3). h, eficiencia de recubrimiento de mutantes sensibles a 5FU con las concentraciones indicadas de trimetoprima (P = 2,5 × 10−4, 7,6 × 10−4, 3,3 × 10−3). Los gráficos de barras representan la media de n = 3 experimentos biológicamente independientes a menos que se indique lo contrario, y las barras de error indican intervalos de confianza del 95%. Los valores de P se calculan utilizando la prueba t independiente (bilateral).

Datos fuente

BCM actúa inhibiendo el factor de terminación de la transcripción Rho. Trabajos anteriores han demostrado que la velocidad de la polimerasa determina la eficiencia de la terminación Rho32. Para probar si los mutantes sensibles tanto a 5FU como a BCM tienen una RNAP más rápida, medimos su tasa de elongación utilizando un ensayo qPCR multisonda a lo largo del operón lac y su frecuencia de pausa utilizando la secuenciación de transcripción de elongación nativa (NETseq)4,43. De hecho, estos mutantes tienen una tasa de alargamiento más alta (Fig. 4d) y se detienen con menos frecuencia (Fig. 4e) que la RNAP de tipo salvaje.

Consideramos la posibilidad de que las altas tasas de transcripción en mutantes RNAP rápidos agoten los grupos de nucleótidos, lo que resulta en sensibilidad a 5FU. Un objetivo conocido del 5FU es thyA, que codifica la enzima responsable de la síntesis de dTMP. dUMP, el sustrato para esta reacción enzimática, se produce a partir de ribonucleótidos de pirimidina. Por lo tanto, una cepa en el conjunto de ribonucleótidos de pirimidina sensibilizaría las células al 5FU44,45. Utilizando cromatografía líquida híbrida-espectrometría de masas (LC-MS), encontramos que los mutantes sensibles a 5FU carecen de las dos pirimidinas detectables, uridina y citidina trifosfato, al nivel de un mutante upp deficiente en recuperación de uracilo (Fig. 4f). 15Y, un mutante increíblemente sensible al 5FU, también carece de purinas (Datos ampliados, figura 9d). De hecho, la suplementación con timidina rescató la sensibilidad a 5FU de los mutantes 15Y, 26V y 27W (Fig. 4g), así como el defecto de crecimiento de 15Y en condiciones normales de crecimiento a 37 ° C (Datos ampliados, Fig. 9e). Es de destacar que los cambios modestos en el nivel de expresión de los genes de biosíntesis de nucleótidos no explican la sensibilidad a 5FU de los mutantes rápidos (Datos ampliados, figuras 8 y 9a a c).

Debido a que el 5FU inhibe el crecimiento bacteriano a través de un mecanismo complejo que incluye no solo el agotamiento de dTMP, sino también la mala incorporación al ADN y al ARN, buscamos establecer la sensibilidad al agotamiento de dTMP mediante ensayos específicos de timidina. En primer lugar, probamos si los mutantes rápidos eran más susceptibles a la "muerte sin timina" mediante la construcción de mutantes rápidos en un entorno genético de thyA, que requiere suplementos de timidina para el crecimiento. Cuando se elimina la timidina, las células pueden subsistir con las reservas existentes de dTMP durante una "fase de resistencia" antes de que se pierda la viabilidad46. Para respaldar un agotamiento más rápido de la timidina intracelular, los mutantes rápidos en un fondo de thyA tienen una fase de resistencia más corta que la RNAP de tipo salvaje (Datos ampliados, figura 9f). En particular, el rpoB 513P, bien estudiado, un RNAP15,47 lento, es más resistente al 5FU y tiene una fase de resistencia prolongada en el ensayo de muerte sin timino (Datos ampliados, Fig. 9g, h). En segundo lugar, probamos la sensibilidad de los mutantes rápidos hacia la trimetoprima. Este antibiótico clínicamente importante inhibe la dihidrofolato reductasa, que es necesaria para la síntesis de novo de timidina además de ciertos aminoácidos48. Debido a que el medio LB es limitado para la timidina, su disponibilidad afecta la sensibilidad general a la trimetoprima. De acuerdo con nuestro modelo de agotamiento de nucleótidos, los mutantes rápidos de RNAP también son más sensibles a la trimetoprima (Fig. 4h). En conjunto, estos resultados indican que la velocidad de RNAP determina la disponibilidad de nucleótidos dentro de la célula.

Todos los mutantes de RNAP rápidos que aislamos parecen tener una ventaja de aptitud en el formato de detección original (Datos ampliados, figuras 1a y 2), que se realizó a temperaturas más bajas adecuadas para cepas recombinantes de MAGE1. Cuando se reconstruyen en MG1655, los mutantes rápidos no tienen tal ventaja de crecimiento a 37 °C, pero todos crecen más rápido y se saturan a una DO más alta que las células de tipo salvaje a una temperatura más baja de 25 °C (Datos ampliados, Fig. 10a). Los mutantes 5FUR crecen lentamente a 25 °C (Datos ampliados, figura 10b). A 42 °C, los mutantes rápidos 15Y y 27W son sensibles a la temperatura y crecen más lentamente (Datos ampliados, figura 10b). Trabajos anteriores han demostrado la sensibilidad a la temperatura del mutante 526Y resistente al Rif de origen natural, que también se sabe que es un RNAP7 rápido. Debido a que las polimerasas rápidas terminan de manera ineficiente, planteamos la hipótesis de que una mayor lectura podría proporcionar una ventaja de crecimiento a 25 °C. De hecho, las células de tipo salvaje con cantidades subinhibitorias de BCM crecen más rápido a 25 °C (Datos ampliados, figura 10c). A partir de estos datos, identificamos que la RNAP rápida proporciona una ventaja de crecimiento a temperaturas más bajas, al menos en parte debido a una mala eficiencia de terminación.

En resumen, nuestra caracterización de mutantes RNAP rápidos del sitio de unión Rif condujo a la observación de que la velocidad de transcripción controla la disponibilidad de nucleótidos dentro de la célula. Los grupos de nucleótidos son limitantes y los aumentos marginales en la velocidad de RNAP sensibilizan en gran medida a las células a los antibióticos que se dirigen a la biosíntesis de nucleótidos. Además, la RNAP rápida también afecta los entornos de crecimiento deseables para las bacterias, lo que plantea la cuestión de si tales mutaciones aparecen en la naturaleza.

Nuestro objetivo fue informar nuestro estudio de mutantes rpoB explorando la diversidad de secuencias naturales. Tras la alineación de alrededor de 4000 ortólogos de E. coli rpoB extraídos de KEGG49, observamos una alta conservación evolutiva en el sitio de unión de Rif por la divergencia de Jensen-Shannon50 (Fig. 5a). A continuación, agrupamos las especies por filo o clase y determinamos el número y el tipo de sustituciones que separan los ortólogos de E. coli MG1655 rpoB dentro del sitio de unión Rif. Dentro de esta ventana de 38 aminoácidos, la mayoría de las especies disponibles para el análisis contenían menos de cinco sustituciones, apareciendo sustituciones leves en proteobacterias estrechamente relacionadas (Fig. 5b, c). Como era de esperar en una región funcionalmente conservada de RNAP, las sustituciones más comunes son entre aminoácidos del mismo grupo funcional con la excepción de S522A, una sustitución de hidróxica a alifática que se encuentra en cerca del 10% de las especies encuestadas (Fig. 5b, cy Datos ampliados Fig. 2).

a, Conservación evolutiva de rpoB por divergencia de Jensen-Shannon basada en la alineación de 4055 secuencias. Los valores más altos indican una mayor conservación. Las posiciones se basan en MG1655 rpoB y el sitio de unión Rif está resaltado en gris. b, c, Número total de sustituciones (b) y frecuencia de sustituciones de residuos específicos (c) que separan a los 4.055 ortólogos rpoB encuestados de MG1655 agrupados por filo. Las proteobacterias se subdividen a su vez por clases. Los filos con menos de 40 especies representativas se combinan en "otros". Por razones de brevedad, se omiten las sustituciones encontradas en menos de 20 especies. En el diagrama de caja, los extremos inferior y superior del cuadro indican Q1 y Q3, respectivamente. Los bigotes se extienden 1,5 × (Q3 – Q1) desde cada lado de la caja. d, Diagramas de dispersión de la frecuencia de sustitución en la naturaleza en comparación con la aptitud, la sensibilidad y la resistencia de la sustitución. Por motivos de brevedad, se omiten las sustituciones encontradas en menos de 20 especies. El naranja denota sustituciones con fenotipos significativos (P <01) en cada pantalla. Los valores de P se calculan utilizando la prueba t independiente (bilateral).

Datos fuente

Al comparar la aptitud posicional promedio con la conservación evolutiva, vemos una correlación negativa como se esperaba (Datos ampliados, Fig. 10d). Generalmente, las posiciones altamente conservadas son menos mutables, excepto en algunos casos. Por ejemplo, la histidina en 526 está altamente conservada pero es mutable en nuestra pantalla de fitness. Mutar esta posición probablemente sea perjudicial en otros sentidos, razón por la cual rara vez se encuentra en la evolución. Por ejemplo, las mutaciones en esta posición son muy sensibles al 5FU (datos ampliados, figura 10d).

La aptitud posicional promedio es limitada para determinar los efectos de las variantes de un solo residuo que se encuentran en la naturaleza. Para especular cómo podría evolucionar la variación natural en el sitio de unión de Rif, comparamos la frecuencia de la variación natural con la aptitud de sustitución en cada modalidad de detección (Fig. 5d). Entre las variantes naturales con fenotipos fuertes más comunes en nuestro mercado, 24L, 26N y 67Q son las más destacadas. 24L se encuentra en más del 10% de las especies encuestadas, tiene características de RNAP rápido y aparece con poca frecuencia en Proteobacteria, pero más comúnmente en Actinobacteria y Firmicutes (Fig. 5c, d y Datos ampliados, Figs. 2 y 3). 26N se encuentra en el 1% de las especies encuestadas, tiene características de una RNAP rápida con alto nivel de resistencia a Rif y aparece en Tenericutes (Fig. 5c, d y Datos ampliados, Figs. 2 y 3); Los géneros notables incluyen Mycoplasma, que ha demostrado ser resistente al Rif9. 67Q proporciona resistencia tanto a BCM como a 5FU y se encuentra en -Epsilonproteobacteria y los Aquificae estrechamente relacionados; las especies notables incluyen Helicobacter y Campylobacter (Fig. 5c, d). Se ha demostrado que algunas cepas de Epsilonproteobacteria son resistentes al 5FU51. Será necesario realizar trabajos futuros para caracterizar los efectos de las mutaciones identificadas en estos organismos.

Para aprovechar décadas de trabajo con mutantes resistentes a RNAP y al mismo tiempo evitar el sesgo de caracterizar los sitios de unión de antibióticos a través de la lente de la resistencia, presentamos una colección completa de mutantes de un solo residuo del sitio de unión de Rif. Con nuestra colección, observamos que el sitio de unión de Rif es sorprendentemente mutable y que las mutaciones funcionales no son exclusivas de la resistencia a Rif y no pueden apreciarse completamente sin saturar la mutagénesis (Figs. 1 y 2 y Datos ampliados, Figs. 1-3). Ampliamos el conocido 'resistoma' de Rif al identificar que casi todas las sustituciones en las posiciones 516, 526 y 572 generan una resistencia de alto nivel (Figs. 2 y 3a). Muchas de estas mutaciones resistentes no ocurren de forma natural, probablemente porque requieren múltiples sustituciones de nucleótidos. Además, identificamos una única hélice alfa que tiene un papel crítico en la unión de Rif, donde las mutaciones causan resistencia de alto nivel (S522 y H526) o mayor sensibilidad (L521 y T525) (Figs. 2 y 3a). Estos datos proporcionan un mapeo genético detallado de las interacciones ligando-enzima que será valioso para los químicos medicinales que trabajan para aumentar la potencia de los antibióticos.

Descubrimos mutaciones de residuo único de RNAP que convierten a Rif en un fármaco bactericida en E. coli (Fig. 3). Mostramos que estas mutaciones actúan prolongando la unión de Rif, ya que la polimerasa mutante tarda en recuperarse del tratamiento con Rif tanto in vivo como in vitro (Fig. 3d y Datos ampliados, Fig. 4d), el comportamiento de otros fármacos bacteriostáticos no cambia (Datos ampliados). Fig. 5e, f), los mutantes no tienen ningún defecto de aptitud (Datos ampliados, Fig. 2) y no observamos reprogramación de la expresión genética (Datos ampliados, Figs. 8 y 9a-c). De manera similar, los macrólidos de próxima generación son bactericidas en virtud de una mayor afinidad por el ribosoma que la del fármaco bacteriostático original14,52.

Anteriormente se había observado que los mutantes de reparación de daños en el ADN tenían una mayor sensibilidad a Rif33. En este trabajo, observamos directamente que Rif provoca roturas del ADN bicatenario en los promotores, induce la respuesta SOS y mata a los mutantes RifHS (Fig. 3 y Datos ampliados, Figs. 5a – d y 6a – c). Mostramos que los efectos bactericidas se exacerban en mutantes RifHS deficientes en la reparación de DSB y también en células recA de tipo salvaje, lo que indica que Rif también daña el ADN en células de tipo salvaje, pero no hasta el punto de causar la muerte celular (Fig. 3g). . De acuerdo con trabajos anteriores, encontramos que los efectos bactericidas de Rif no dependen de ROS (Datos ampliados, figuras 6d-f), lo que indica un mecanismo distinto de otros antibióticos bactericidas36,37. En cambio, observamos que Rif causa daño al ADN y mata solo cuando las células se están replicando activamente (Fig. 3i y Datos ampliados Fig. 7). Se sabe que la RNAP detenida en el promotor presenta un obstáculo para el replicasoma y se ha demostrado que los conflictos de transcripción-replicación causan mutaciones perjudiciales39,40. Nuestros resultados indican que Rif daña el ADN mediante un mecanismo similar. Será necesario realizar trabajos futuros para probar este modelo en otras bacterias. Estos hallazgos implican que mejorar la afinidad de unión de Rif puede acortar los tiempos de tratamiento y ampliar su espectro de actividad antimicrobiana. Además, el descubrimiento de que Rif actúa a través de un mecanismo único para causar daño al ADN puede informar el diseño de una terapia antimicrobiana combinada.

Descubrimos en nuestra colección otras mutaciones de un solo residuo que producen RNAP rápido, similar al mutante H526Y resistente a Rif bien caracterizado y otros mutantes de RNAP15,21,53. Observamos que las altas tasas de transcripción agotan los nucleótidos de pirimidina, de modo que estos mutantes se vuelven particularmente vulnerables a un mayor agotamiento a través de la inhibición de thyA54 por 5FU (Fig. 4). Es importante destacar que los medios de crecimiento suplementados con timidina pueden rescatar la sensibilidad al 5FU de la RNAP rápida (Fig. 4g). Observamos que la suplementación con timidina no hace que las células sean completamente resistentes al 5FU. La mala incorporación de dUTP y su análogo 5-fluoro durante la replicación, así como la mala incorporación de 5FU durante la transcripción, pueden contribuir a los efectos antimicrobianos del 5FU. El agotamiento de nucleótidos por RNAP rápido también hace que las células sean más susceptibles a la muerte sin timina (Datos ampliados, Fig. 9f) y al antibiótico clínicamente importante trimetoprim (Fig. 4h). La transcripción de alta velocidad también sensibiliza a las células al antibiótico BCM debido a su pobre eficiencia de terminación; sin embargo, descubrimos que una terminación deficiente proporciona una ventaja de crecimiento a temperaturas más bajas (Datos ampliados, figura 10c). En conjunto, estos resultados demuestran que la velocidad de transcripción determina la disponibilidad de nucleótidos, puede alterar la sensibilidad a los antibióticos y puede cambiar la temperatura óptima de crecimiento de las bacterias.

A pesar de la alta conservación evolutiva del sitio de unión de Rif, identificamos mutaciones funcionales de RNAP que existen con alta frecuencia en la naturaleza. 524L y 526N comparten características con mutantes de RNAP rápidos y están ubicados en la hélice alfa que identificamos como importante para la unión de Rif (Figs. 2 y 3). Como tal, 526N proporciona resistencia Rif de alto nivel y aumenta la sensibilidad a 5FU, pero no en el mismo grado que 526Y (Datos ampliados, figura 3). Es intrigante ver que la resistencia clínica, que se desarrolla relativamente rápido, supone un coste de aptitud física mayor que la resistencia que se desarrolló a lo largo de millones de años de evolución. También es interesante especular por qué Tenericutes y otros filos portarían esta mutación. Quizás vivían cerca del Rif produciendo bacterias. rpoB 567Q, que se encuentra en el 2% de las especies encuestadas, proporciona un alto nivel de resistencia tanto al 5FU como al BCM. Observamos que las especies que portan estas mutaciones viven en ambientes hostiles, como respiraderos hidrotermales y tractos digestivos de animales. Estas mutaciones no fueron el tema central de este artículo, pero probablemente sean mutantes lentos y estrictos de RNAP, similares a 513P16 (Datos ampliados, Fig. 9g,h), y especulamos que aumentan la tolerancia a vivir en condiciones limitantes de nucleótidos o nutrientes. .

En conjunto, nuestra caracterización de alta resolución del sitio de unión de Rif revela varios subtipos de RNAP, algunos de los cuales se pueden encontrar en la naturaleza. Encontramos RNAP que es exquisitamente sensible al Rif, convirtiéndolo en un antibiótico bactericida en una bacteria gramnegativa a través de un mecanismo único de daño al ADN. También encontramos que la velocidad de transcripción determina la disponibilidad de nucleótidos dentro de la célula y puede alterar la susceptibilidad a los antibióticos. Nuestro estudio ilumina el sitio de unión de los antibióticos como un dominio multifuncional de enzimas esenciales e inspira una caracterización similar de otros objetivos antibióticos importantes para ampliar nuestra comprensión de los mecanismos antibacterianos, la fisiología bacteriana y la evolución.

Se utilizó MAGE con la cepa 1 de E. coli EcNR2 para generar un conjunto de sustituciones de sitios de unión Rif de residuo único que comprenden rpoB 510–537 y 563–572. Se diseñaron 760 oligos MAGE (Integrated DNA Technologies) para generar 20 posibles mutantes de un solo residuo en 38 posiciones. Para limitar la detección de mutaciones de fondo y aumentar aún más la especificidad de nuestro enfoque, diseñamos específicamente nuestra biblioteca MAGE para producir sustituciones de codones únicos que incluyan múltiples alteraciones de nucleótidos cuando sea posible. Se realizó una sola ronda de mutagénesis MAGE en cuatro contenedores que comprenden 510–518, 519–527, 528–537 y 563–572. Las células se recuperaron durante la noche y se almacenaron en glicerol.

Para comenzar un experimento de detección, se descongelaron las células, se combinaron los contenedores y se dejaron recuperar hasta una DO a 600 nm (OD600) de 0,4, momento en el que se tomó una alícuota como T0. Luego, las células se sometieron a un "formato de recuperación" para el tratamiento con Rif o un "formato MIC" para el tratamiento con BCM o 5FU (Sigma). En el 'formato de recuperación', las células se trataron con 50 µg ml-1 de Rif (Sigma) durante 1 h, se lavaron con LB, se diluyeron diez veces y se dejaron recuperar hasta la DO antes de la dilución antes de recolectarse (fármaco T1). En el 'formato MIC', las células se diluyeron diez veces y se trataron con BCM (15 o 30 µg ml-1) o 5FU (1 o 5 µg ml-1) y se dejaron recuperar hasta la DO antes de la dilución antes de ser recolectadas (fármaco T1). . Las células no tratadas se cultivaron en paralelo para medir y controlar la aptitud mutante (aptitud T1). Las células no tratadas también se pasaron sobre placas de agar colocando las células en placas y raspando las colonias después de una incubación durante la noche. Todo el cribado se realizó por triplicado. El formato de detección que utilizamos dependió del fármaco seleccionado. Debido a que Rif es un fármaco bacteriostático37, no esperábamos que los mutantes sensibles disminuyeran en abundancia. Afortunadamente, trabajos anteriores han demostrado que Rif produce un "efecto post-antibiótico" en el que las células muestran un retraso en la recuperación después de que Rif se elimina por lavado y se permite que las células reanuden su crecimiento55,56. Por esta razón, diseñamos un formato de recuperación en el que los grupos de rpoB mutantes se trataron primero con Rif, se lavaron, se diluyeron diez veces y luego se dejaron recuperar. Se esperaría que los mutantes sensibles se recuperaran más lentamente y luego se encontrarían en menor abundancia. Como tanto BCM como 5FU son bactericidas37,54,57, esperábamos que los mutantes sensibles murieran y disminuyeran en abundancia. Por lo tanto, se seleccionaron dos concentraciones para cada fármaco: una concentración en la CIM en la que solo sobrevivirían los mutantes resistentes y otra en una concentración más baja en la que se perderían los mutantes sensibles. Aislamos los efectos específicos de los fármacos normalizando las abundancias de mutantes entre los tratados con el fármaco (fármaco T1) y los no tratados (T1 LB).

El ADN genómico se preparó a partir de células recolectadas con el kit de purificación de ADN genómico Monarch (NEB). Las bibliotecas se prepararon en dos contenedores que comprenden rpoB 510–537 y 563–572. Aquí, 100 ng de ADN se sometieron por primera vez a dos ciclos de PCR en una reacción de 50 µl que contenía polimerasa Q5 (NEB) y cebadores 1 µM (Tabla complementaria 2) diseñados para adjuntar un código de barras único de 14 nucleótidos degenerados para corregir los duplicados de PCR durante el análisis. Después de adjuntar el código de barras, las reacciones se trataron con 1 µl de exonucleasa I (NEB) para eliminar los códigos de barras no utilizados durante 1 hora a 37 °C y luego se purificó el ADN utilizando una proporción de 1,5 × de perlas PCRClean DX (Aline Biosciences). Luego se unieron índices de códigos de barras de muestra y secuencias de adaptadores de secuenciación con 18 ciclos de PCR exponencial antes de 2 rondas de purificación con una proporción de perlas de 1x. Las bibliotecas se secuenciaron con el cartucho Novaseq 6000 SP300 (Illumina), con el objetivo de recopilar 40 millones de lecturas por biblioteca y 2 × 106 códigos de barras únicos para cada muestra experimental, lo que permitió la observación de 20 a 20 000 instancias de cada mutante.

Los adaptadores de secuenciación se recortaron utilizando CutAdapt58. A continuación, las secuencias se filtraron para determinar la longitud correcta y las secuencias de cebador, y luego se agruparon en "familias" mediante los códigos de barras de nucleótidos antes mencionados. Se comprobó que las familias que representaban una molécula genómica original tenían un consenso del 80% por nucleótido, utilizando de forma predeterminada la secuencia de tipo salvaje en caso de que no hubiera consenso y luego se tradujeron a la secuencia de aminoácidos diseñada. Las familias se agruparon por mutante y el número de familias correspondientes a un único mutante se dividió por el número total de familias para obtener la frecuencia de mutantes. Sólo se consideraron para el análisis mutantes de un solo residuo. Para determinar la aptitud de los mutantes, las abundancias de mutantes después del crecimiento (aptitud T1) se normalizaron a las abundancias antes del crecimiento (T0). Para determinar los efectos específicos de los fármacos, las abundancias de mutantes después del tratamiento farmacológico (fármaco T1) se normalizaron a las abundancias después del crecimiento en LB (aptitud T1).

Para todos los experimentos de validación, se utilizó E. coli MG1655 de tipo salvaje como cepa parental (Tabla complementaria 1). Para generar mutantes rpoB seleccionados para la reconstrucción en MG1655, utilizamos MAGE para introducir un casete de kanamicina en el extremo 3 'de rpoC en la cepa EcNR2 de E. coli. Se generaron mutantes rpoB seleccionados en el EcNR2 rpoc:kn de E. coli resultante. Se utilizó la transducción mediada por fagos P1 para mover mutantes a MG1655. Para las cepas knockout, se utilizó pKD46 como se describió anteriormente59.

Los cultivos nocturnos de las cepas indicadas cultivadas en LB se diluyeron 10.000 veces y se controló el crecimiento en 0,2 ml de LB a 37 °C en una máquina Bioscreen C (Growth Curves USA). Los valores de CIM se definieron como la concentración mínima de antibiótico para más del 90% de inhibición del crecimiento después de 15 h. Para los ensayos de MIC y MBC que cumplen con los estándares clínicos60, se incubó un inóculo inicial de 5 × 105 células con concentraciones crecientes de Rif en caldo Mueller-Hinton a 37 °C durante 18 h. La CIM se determinó cuando al menos el 90 % del crecimiento bacteriano se inhibe según la DO600. El MBC se determinó como la concentración más baja de agente antibacteriano que reduce la viabilidad del inóculo bacteriano inicial en al menos un 99,9% después de 18 h a 37 °C.

Los cultivos nocturnos de las cepas indicadas cultivadas en LB se diluyeron 1.000 veces y se cultivaron hasta una DO600 de 0,2 en 2 ml de medio antes de añadir la concentración indicada de Rif (Sigma), ampicilina (Sigma), cloranfenicol (Sigma), tetraciclina. (Sigma), 2,2′-dipiridilo (Sigma) o tiourea (Sigma). Después de 1 h de tratamiento, las células se lavaron dos veces con un volumen igual de LB. Se realizaron diluciones en serie de las células lavadas y se sembraron en placas de agar LB o se colocaron en una máquina Bioscreen C para controlar el crecimiento. Para los experimentos de suplementación con timidina, el agar LB se complementó con la concentración indicada de timidina (Sigma) y 5FU (Sigma). Para los experimentos de bloques de replicación, se construyeron cepas en el fondo de PC2 que portaban un alelo sensible a la temperatura de la proteína de replicación del ADN dnaC39,42. Las células se cultivaron como se indica hasta una DO600 de 0,2 a 30 °C antes de cambiarlas a 42 °C durante 1,5 h. Luego, las células se agregaron a medios con 80 µg ml–1 de Rif precalentados a 42 °C durante 30 minutos antes de lavarlas y sembrarlas en agar LB. La viabilidad de las células se calculó normalizando el número de colonias tratadas con respecto a las no tratadas.

El mutante rpoB se clonó en el vector PVS10 para la expresión recombinante y la purificación del núcleo RNAP de E. coli como se describió anteriormente61. Se mezclaron más de 3 pmol de núcleo de RNAP con σ70 equimolar y ADN molde con la secuencia: tccagatcccgaaaatttatcaaaaagagtattgacttaaagtc taacctataggatacttacagccATCGAGAGGGCCACGGCGAACAGCCAACCCAATCGAACAGGCCTGCTGGTAATCGCAGGCCCTTTTTATTTGGATCCCCGGGTA (las letras mayúsculas indican la secuencia transcrita) en 20 µl de TB 50 tampón (Tris-HCl 20 mM, pH 8; MgCl2 10 mM, NaCl 50 mM, 0,03 % Igepal-60) y se incubaron 5 min a 37 °C. Luego, los complejos de transcripción ensamblados se trataron con 2 µl de Rif (20 µg ml–1) y se incubaron durante 5 minutos a 37 °C antes de transferirlos a 10 µl de perlas de NeutrAvidin (Fisher) y agitar durante 5 minutos a 25 °C. Las muestras se lavaron cuatro veces con 1 ml de TB50. Se añadió trifosfato de adenosina (ATP), trifosfato de guanosina (GTP), trifosfato de uridina (UTP) y trifosfato de citidina (CTP) 5 µM premezclados con CTP-αP32 a 1 mM y se incubó a 37 °C. Luego se tomaron alícuotas de 10 µl después de 3, 5, 10, 20, 30 o 40 min y se mezclaron con SB (1x tris-borato-EDTA (TBE); EDTA 20 mM; urea 8 M; xileno cianol al 0,025%, 0,025% azul de bromofenol), calentado durante 5 min a 100 °C y cargado en un gel de poliacrilamida al 30% (20 × 20 cm2) (19:1) con urea 7 M y preejecución de TBE durante 6 min. El gel se hizo funcionar durante 50 minutos a 50 W antes de transferirlo a una película de rayos X para exposición durante la noche. La intensidad del gel se cuantificó utilizando GelQuant.NET.

Se diluyeron cultivos nocturnos de rpoB rpoC-10X-His de tipo salvaje y rpoB T525D rpoC-10X-His 1.000 veces y se cultivaron hasta una DO600 de 0,2 en 25 ml de LB a 37 °C antes de la adición de 80 µg ml–1 Rif. Después del tratamiento durante 1 h, las células se lavaron una vez en un volumen igual de LB. Se permitió que las células se recuperaran durante 1 h en LB a 37 °C antes de reticularlas con formaldehído al 1% a 37 °C durante 20 min. Se añadió una concentración final de glicina 250 mM para detener la reacción. Las células se recogieron mediante centrifugación a × 5000 gy se lavaron dos veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS) enfriada con hielo antes de resuspenderlas en 1 ml de tampón de lisis (Tris 10 mM, pH 8,0, NaCl 100 mM, EDTA 1 mM, EGTA 1 mM, 0,1% desoxicolato de sodio, 0,5% N-lauroilsarcosina) más 2 mg ml-1 de lisozima con inhibidor de proteasa (Roche) y se incubaron a 37 °C durante 30 min. El ADN se cortó utilizando un ultrasonido Covaris M220 en un ciclo de 10 s encendido/10 s apagado durante un total de 50 ciclos. El sobrenadante se incubó con 5 µg ml–1 de anticuerpo 6X-His-tag (Proteintech) y se incubó a 4 °C durante la noche.

Luego, se preequilibraron 50 µl por muestra de perlas de proteína A/G con 1 ml de PBS 1x + albúmina sérica bovina (BSA) al 0,5 % enfriado con hielo y se incubaron con las muestras durante 0,5 h a 4 °C. Las muestras se lavaron cinco veces en 1 ml de tampón RIPA (HEPES 50 mM, pH 7,5, LiCl 250 mM, EDTA 1 mM, NP40 al 1%, desoxicolato de sodio al 0,7%) y se les dio un lavado final en 1 × TE (Tris-Cl 100 mM). pH 8, EDTA 10 mM, pH 8). Los complejos se desentrecruzaron en 250 µl de 1× TE + 4 µl de ARNasa durante 1 h a 37 °C y luego se dejaron durante la noche a 65 °C con dodecilsulfato de sodio (SDS) al 1% y 1 mg ml-1 de proteinasa K. El ADN se purificado con ChIP Clean and Concentrate (Zymo). Los experimentos con ChIP se realizaron por duplicado.

Para la secuenciación, las bibliotecas de muestras se prepararon utilizando el kit de biblioteca NEBNext ChIP-seq (NEB) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las bibliotecas se comprobaron en TapeStation 2200 (Agilent) para realizar controles de calidad. Las muestras se secuenciaron en NextSeq 2000 (Illumina). Se utilizaron Bowtie62 y Deeptools63 para la alineación y el análisis, respectivamente.

Para los experimentos de fragmentación de ADN, las células se diluyeron 1000 veces a partir de cultivos nocturnos y se cultivaron hasta una DO600 de 0,2 en 2 ml de medio antes de agregar 80 µg ml–1 de Rif o 125 ng ml–1 de norfloxacina. Después de 1 h de tratamiento, las células se lavaron dos veces con un volumen igual de LB antes de fijarlas con formaldehído al 4% para el desoxinucleótido terminal TUNEL. El etiquetado de fragmentos de ADN se realizó utilizando el kit Apo-Direct (BD Bioscience) siguiendo las instrucciones del fabricante. Las muestras se recogieron con un citómetro de flujo FACSCalibur (BD Biosciences) y se recogieron al menos 50.000 células para cada muestra. El porcentaje de células TUNEL positivas para una condición determinada es el porcentaje de células que exceden la señal detectada en más del 99% de las células no tratadas.

El número de DSB en el ADN genómico se determinó mediante SLR-qPCR38. SLR-qPCR se puede utilizar para la detección de cualquier lesión o rotura de cadena que cree una barrera para la amplificación por la ADN polimerasa64. Para cuantificar los DSB en el ADN genómico, las cepas indicadas se inocularon en LB. Los cultivos nocturnos de las cepas indicadas se diluyeron 1.000 veces en LB y se dejaron crecer hasta una DO600 de 0,2 a 37 °C. Las células se trataron con Rif (80 µg ml–1) o con el disolvente portador dimetilsulfóxido (DMSO) durante 1 h a 37 °C. Las células se recogieron mediante centrifugación y se lavaron dos veces con PBS. El ADN genómico se aisló utilizando un kit de aislamiento de ADN genómico Monarch (NEB).

La mezcla de reacción contenía 1x mezcla SYBR Green (Applied Biosystems), 500 nM de cada cebador y 1 ng de ADN molde en un volumen total de 20 µl por pocillo. Dos conjuntos de cebadores (Tabla complementaria 3), que producen un amplicón corto y uno largo, proporcionan datos que representan la cantidad total de plantilla (un control de normalización interno) y ADN no dañado, respectivamente. Los dos pares de cebadores tuvieron una eficiencia de amplificación comparable y produjeron un único producto de PCR a juzgar por el análisis en gel de agarosa. El análisis de los datos se realizó como se describe38 utilizando una versión modificada del método 2-ΔΔCT. La densidad de DSB se midió utilizando ADN genómico de células no tratadas como referencia. El daño al ADN se calculó como DSB por 10 kilobases de ADN.

Para los experimentos de bloques de replicación, se introdujo en las células de interés un sistema de plásmido dual que expresa dCas9 y un ARN guía dirigido a oriC, como se informó anteriormente41. Las células se cultivaron hasta una DO600 de 0,2 a 37 °C como se describió anteriormente, y se indujo dCas9 con 200 ng ml-1 de Tc durante 30 minutos antes de agregar Rif.

Las células se diluyeron 1000 veces a partir de cultivos nocturnos y se cultivaron hasta una DO600 de 0,2 en 2 ml de medio antes de agregar 80 µg ml–1 de Rif o 10 µg ml–1 de ampicilina. Las células se incubaron con antibiótico durante 30 minutos antes de la adición de carboxi-H2DCFDA 10 mM (Thermo), después de lo cual las células se incubaron durante otros 30 minutos. Luego, las células se lavaron con un volumen igual de PBS, se normalizaron según el número de células y se transfirieron a una placa opaca de 96 pocillos, después de lo cual se midió la intensidad fluorescente con un lector de microplacas. Se usó un pocillo en blanco cargado con un volumen igual de PBS para controlar la fluorescencia de fondo.

Las células se diluyeron 1000 veces a partir de cultivos nocturnos y se cultivaron hasta una DO600 de 0,2 en 2 ml de medio antes de la adición de 80 µg ml–1 Rif durante 1 h. Luego se recogieron las células, se resuspendieron en tampón de lisis (Tris-HCl 10 mM, pH 7,5, SDS al 4%), se mezclaron con tampón de muestra de dodecilsulfato de litio (LDS) 4x (Invitrogen) y se hirvieron a 95 °C durante 10 minutos antes de cargar. en un gel prefabricado NuPAGE 4–12% Bis-Tris (Thermo) para electroforesis a 200 V durante 40 min. Luego, el gel se transfirió semiseco a una membrana de difluoruro de polivinilideno (PVDF) (Millipore) y se incubó con los anticuerpos especificados a 4 °C durante la noche en tampón de bloqueo SuperBlock T20 (Thermo) antes del desarrollo al día siguiente. Los anticuerpos utilizados fueron mAB de ratón clon 8RB13 del anticuerpo monoclonal beta RNAP de E. coli a 1:2000 (663905; Biolegend) y anticuerpo LexA (E-7) a 1:200 (sc-365999; Santa Cruz). La intensidad del gel se cuantificó utilizando GelQuant.NET.

El ARN se preparó a partir de células tratadas con 80 µg ml–1 de Rif durante 1 h utilizando Trizol y Direct-zol RNA microprep (Zymo). La RT-qPCR se realizó con 100 ng de ARN con el kit Luna RT-qPCR (NEB) y Quantstudio 7 (Applied Biosystems) utilizando cebadores dirigidos a rpsL como control (Tabla complementaria 5).

Se prepararon bibliotecas de secuenciación de ARN a partir de células de registro medio cultivadas en LB con el kit de preparación de biblioteca de ARN direccional NEB Ultra II para Illumina (NEB, E7760S). Las lecturas se recortaron con Cutadapt y luego se alinearon con el genoma de E. coli con Bowtie2 (ref. 62). Se utilizó DESeq2 (ref. 65) para analizar la expresión diferencial.

Las células de log medio cultivadas en LB se centrifugaron, se lavaron con PBS y se resuspendieron en 1 m; de tampón de extracción enfriado con hielo seco (50% metanol, 1% ácido fórmico, 10 µM UTP marcado; 13C9, 15N2) optimizado para la extracción UTP. Las células se transfirieron a tubos Beadblaster (Benchmark Scientific) y se homogeneizaron con diez ciclos (30 s encendido, 30 s apagado). Las muestras homogeneizadas se transfirieron a un vial de vidrio de 2 ml y se agitaron con 0,4 ml de agua calidad HPLC y 0,8 ml de cloroformo. Luego, las muestras se incubaron a 4 °C durante 30 minutos y el sobrenadante se separó y se secó en un SpeedVac (Thermo Scientific) antes de resuspenderse en 40 µl de agua calidad HPLC. Luego, la muestra resuspendida se centrifugó para eliminar los residuos y se transfirió a un inserto de vidrio de 250 µl para el análisis LC-MS en el núcleo de metabolómica de NYU.

Las tasas de alargamiento de la transcripción se midieron con un ensayo de qPCR multisonda (Tabla complementaria 3) a lo largo del operón lac como se describió anteriormente43. Se cultivaron células de E. coli hasta una DO600 de 0,4 antes de la inducción con isopropil beta-d-tiogalactopiranósido (IPTG) 1 mM. Después de la inducción, se retiraron alícuotas a intervalos de 10 s en un tubo que contenía una solución de parada (60% EtOH, 2% fenol, EDTA 10 mM) preenfriada a -20 °C. El ARN se extrajo utilizando Trizol (Invitrogen) y el kit Direct-zol RNA Microprep (Zymo) según las instrucciones del fabricante. Luego, se convirtieron 100 ng de ARN total en ADN complementario utilizando la transcriptasa inversa Superscript IV (ThermoFisher) y RNaseOut (ThermoFisher). La amplificación de qPCR en tiempo real se realizó con SYBR Green (Invitrogen) y Quantstudio 7 (Applied Biosystems). El análisis de los datos se realizó como se describió anteriormente43.

Las bibliotecas NETseq se prepararon y analizaron como se describió anteriormente4, con modificaciones en el algoritmo de llamada de pausa. Las pausas se llamaron utilizando ventanas deslizantes de 100 nucleótidos con la condición de que la pausa sea la señal máxima dentro de la ventana y la señal esté 2 sd por encima de la media de la ventana.

La base de datos de ortología KEGG49 se extrajo en busca de ortólogos de E. coli rpoB y se analizó de manera similar al trabajo realizado previamente con rpoD28. En resumen, se filtraron ortólogos en busca de proteínas bacterianas que tuvieran una longitud similar a la de E. coli rpoB, lo que produjo 1.342 secuencias. A continuación, las secuencias se alinearon con Clustal Omega66 y la divergencia de Jensen-Shannon calculó la conservación posicional50. Las variantes de ortólogos dentro del sitio de unión de rpoB se determinaron comparándolas con rpoB de E. coli MG1655 y se calcularon su número y frecuencia.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen del informe de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Los datos de secuenciación están disponibles a través del archivo de lectura de secuencia (SRA) del NCBI en PRJNA992395. Los datos originales se proporcionan con este documento.

El código para analizar conjuntos de datos MAGE-seq se adaptó de trabajos anteriores28.

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Descargar referencias

Agradecemos a P. Zappile del Centro de Tecnología del Genoma de la Universidad de Nueva York, que cuenta con el apoyo parcial de la subvención de Apoyo al Centro de Cáncer no. P30CA016087, en el Centro Oncológico Laura e Isaac Perlmutter. Agradecemos a Y. Siu y D. Jones del Laboratorio de Recursos Centrales de Metabolómica de la Universidad de Nueva York. Agradecemos a K. Alzoubi por su ayuda con la visualización de datos. Este trabajo fue apoyado por la Blavatnik Family Foundation (EN); Instituto Médico Howard Hughes (EN); subvención de los NIH R01GM126891 (EN); Programa de formación de científicos médicos de la Universidad de Nueva York (KBY); y Premio Institucional de Formación en Investigación del Servicio de Salud Pública núm. T32 AI007180 (KBY).

Departamento de Bioquímica y Farmacología Molecular, Facultad de Medicina Grossman de la Universidad de Nueva York, Nueva York, NY, EE. UU.

Kevin B. Yang, Maria Cameranesi, Manjunath Gowder, Criseyda Martinez, Yosef Shamovsky, Vitaliy Epshtein, Zhitai Hao, Thao Nguyen, Eric Nirenstein, Ilya Shamovsky, Aviram Rasouly y Evgeny Nudler

Instituto Médico Howard Hughes, Facultad de Medicina de la Universidad de Nueva York, Nueva York, NY, EE. UU.

Aviram Rasouly y Evgeny Nudler

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KBY y AR realizaron los experimentos MAGE presentados en las Figs. 1–3 y datos ampliados Figs. 1–3. KBY realizó el análisis de datos y la visualización de datos MAGE y el análisis evolutivo presentado en las Figs. 1 a 5 y datos ampliados Figs. 1–3. KBY, AR y MC prepararon las cepas y realizaron los experimentos de validación presentados en las Figs. 3 y 4 y datos ampliados Figs. 5–9. CM realizó los experimentos de citometría de flujo presentados en la Fig. 3. MG realizó SLR-qPCR y experimentos de cinética de transcripción presentados en las Figs. 3 y 4 y Figura de datos ampliados. 7. Las proteínas purificadas de ZH y VE realizaron ensayos de transcripción in vitro presentados en la Figura de datos ampliados. 4. YS realizó los experimentos ChIP-seq presentados en la Figura 3. TN realizó transferencias Western presentadas en la Figura de datos ampliados 6. E. Nirenstein realizó los ensayos de MIC presentados en la figura 9 de datos ampliados. IS realizó una secuenciación de próxima generación. KBY, AR y E. Nudler diseñaron el proyecto y escribieron el manuscrito con aportaciones de todos los autores. AR y E. Nudler supervisaron el proyecto. Todos los autores discutieron los resultados.

Correspondencia a Aviram Rasouly o Evgeny Nudler.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Nature agradece a los revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Los informes de los revisores pares están disponibles.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

anuncio, mapas de calor representativos de abundancias relativas de mutantes del cribado MAGE-seq en las siguientes condiciones: a, puntos de tiempo 0–2 (T0-2) y placa. T0 representa el grupo de mutantes MAGE-seq inicial. T1 y T2 se obtienen después de diluciones posteriores de 100 veces, lo que permite que las células alcancen la misma DO antes de la cosecha. La placa representa bibliotecas MAGE-seq preparadas a partir de mutantes pasados ​​en medio sólido (agar LB). b, abundancia de mutantes después del cribado con rifampicina. c, abundancia de mutantes después de la detección con 15 (bcmbajo) o 30 ug/ml (bcmalto) de biciclomicina. d, abundancia de mutantes después de la detección con 1 (bajo) o 5 ug/ml (fubajo) de 5-fluorouracilo. Las filas corresponden con las posiciones rpoB 510–537 y 563–572; las columnas corresponden a los 20 aminoácidos junto con los codones de parada. Los cuadrados blancos indican residuos de tipo salvaje. Cada mapa de calor muestra valores de la media de n = 3 experimentos MAGE-seq biológicamente independientes.

Datos fuente

a, Panorama de aptitud de los mutantes rpoB que comparan el punto de tiempo 1 con el punto de tiempo 0. b, Gráfico del volcán de la aptitud del grupo de mutantes. Los codones de parada están en gris. Arriba se muestra el gráfico de estimación de la densidad del núcleo de la distribución de aptitud mutante. c, d, Gráfico de paisaje físico y volcán de mutantes rpoB que comparan aquellos que forman colonias en placas de agar hasta el punto temporal 0. Para (a) y (c), las filas corresponden con la posición de rpoB y las columnas corresponden con las 20 posibles sustituciones de aminoácidos, agrupadas por propiedad. Los cuadrados blancos indican residuos de tipo salvaje. El diagrama de barras del cambio de pliegue posicional promedio se presenta a la derecha del mapa de calor. Todos los experimentos MAGE-seq se realizaron en n = 3 réplicas biológicamente independientes. Los valores de P se calculan utilizando la prueba t independiente (bilateral). Las barras de error indican intervalos de confianza del 95%.

Datos fuente

a – d, las filas del mapa de calor corresponden con la posición rpoB y las columnas corresponden con las 20 posibles sustituciones de aminoácidos, agrupadas por propiedad. Los cuadrados blancos indican residuos de tipo salvaje. El diagrama de barras del cambio de pliegue posicional promedio se presenta a la derecha del mapa de calor. e – h, gráficos de datos de volcanes en (a – d). Todos los experimentos MAGE-seq se realizaron en n = 3 réplicas biológicamente independientes. Los valores de P se calculan utilizando la prueba t independiente (bilateral). Las barras de error indican intervalos de confianza del 95%.

Datos fuente

a, gráfico MA de la sensibilidad y resistencia del grupo de mutantes MAGE a la rifampicina. Los codones de parada están en gris. b, Curvas de crecimiento de recuperación de mutantes hipersensibles después de 1 hora de tratamiento con 80 ug/ml de rifampicina (n = 2). c, CMI de cepas hipersensibles (p <1e-5, 1e-5 de izquierda a derecha). Se incubó un inóculo inicial de 5 × 105 células con concentraciones crecientes de rifampicina en caldo Mueller-Hinton (MH) a 37 ° C durante 18 h. d, Reacción de recuperación de la transcripción in vitro de RNAP L521Y de tipo salvaje y rpoB después del tratamiento y lavado con rifampicina. La ubicación del trímero y el terminador (69nt) se indican con flechas. A continuación se proporciona un diagrama de barras de la relación de intensidad del terminador/trímero en cada momento como el promedio de dos experimentos independientes. e, Visor representativo del genoma de la señal de secuenciación de inmunoprecipitación de cromatina (ChIP-seq) de RNAP T525D de tipo salvaje y rpoB normalizado a la entrada. Las células se recogieron después de 1 h de recuperación en LB de 1 h de tratamiento con 80 ug/ml de rifampicina. Los diagramas de barras y las curvas de crecimiento representan la media de n = 3 experimentos biológicamente independientes a menos que se indique lo contrario, y las barras de error indican intervalos de confianza del 95%. Los valores de P se calculan utilizando la prueba t independiente (bilateral).

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a, Viabilidad en líquido de mutantes hipersensibles tras 1 h de tratamiento con rifampicina. Las células en fase exponencial se trataron con 80 ug/ml de rifampicina durante 1 h a 37 °C antes de lavarlas, diluirlas en serie y medir su crecimiento celular (n = 9, p = 3,1e-2, 3,1e-4 de izquierda a derecha). ). b, Eficiencia de la siembra en placas de mutantes hipersensibles después de 1 h de tratamiento con concentraciones normalizadas de rifampicina por CMI (p = 2,6e-3, 6,0e-4, 9,1e-4, 5,0e-4). Las células en fase exponencial se trataron con 4x o 10x su respectiva concentración inhibidora mínima (CIM) de rifampicina antes de lavarlas, diluirlas en serie y sembrarlas en placas. c, Concentración bactericida mínima (CBM) de cepas hipersensibles (p < 1e-5, 1e-5). El MBC se determinó como la concentración más baja de agente antibacteriano que reduce la viabilidad del inóculo bacteriano inicial en ≥99,9% después de 18 h a 37 °C. La rifampicina se analizó hasta la concentración de 80 ug/ml indicada por el asterisco. d, relación MBC/MIC determinada para cepas hipersensibles a la rifampicina (p <1e-5, 1e-5). e, Eficacia del recubrimiento de mutantes hipersensibles después de 1 h de tratamiento con rifampicina, cloranfenicol (CM) y tetraciclina (TET) (p = 6,2e-1, 3,3e-1, 5,5e-1, 7,1e-1). Las células en fase exponencial se trataron con 80 ug/ml de rifampicina, 20 ug/ml de cloranfenicol o 20 ug/ml de tetraciclina durante 1 hora a 37 °C antes de lavarlas, diluirlas en serie y sembrarlas en LB. f, Eficiencia de siembra en placas de mutantes hipersensibles en cepas knockout recA o recBCD después de 1 hora de tratamiento con 20 ug/ml de tetraciclina a 37 °C. Las células en fase exponencial se trataron con 20 ug/ml de tetraciclina durante 1 hora a 37 °C antes de lavarlas, diluirlas en serie y sembrarlas en LB. Los gráficos de barras representan la media de n = 3 experimentos biológicamente independientes a menos que se indique lo contrario, y las barras de error indican intervalos de confianza del 95%. Los valores de P se calculan utilizando la prueba t independiente (bilateral).

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a, Expresión relativa de genes de respuesta SOS en respuesta a un tratamiento de 1 hora con 80 ug/ml de rifampicina a 37 °C mediante RT-qPCR. Los datos se normalizaron según la expresión de rpsL y luego entre Rif y condiciones no tratadas (n = 5, p = 4,7e-4, 3,7e-3, 1,8e-2, 7,5e-3 de izquierda a derecha). b, niveles relativos de proteína LexA medidos mediante transferencia Western en mutantes hipersensibles en crecimiento exponencial después de 1 hora de tratamiento con 80 µg/ml de rifampicina a 37 °C (p = 2,5e-2, 3,2e-2, 5,4e-3). Los datos se normalizan a los niveles relativos de proteína de rpoB. c, Transferencia Western representativa de datos en (b). d, Especies reactivas de oxígeno (ROS) de células tratadas con ampicilina o rifampicina, medidas por carboxi-H2DCFDA (p = 5,8e-6). Las células en crecimiento exponencial se trataron durante 1 hora con 80 ug/ml de rifampicina o 10 ug/ml de ampicilina a 37 °C. Se añadió carboxi-H2DCFDA 30 minutos antes de la recolección de la muestra. e, Eficacia del recubrimiento de células de tipo salvaje tratadas con ampicilina 10 ug/ml con o sin la adición de 2,2'dipiridilo 500 uM y tiourea 150 mM (n = 5; p = 3,9e-4). f, Eficiencia de la siembra en placas de mutantes hipersensibles después de 1 h de tratamiento con rifampicina 80 ug/ml con o sin la adición de 2,2'dipiridilo 500 uM y tiourea 150 mM (p = 1,5e-4, 1,7e-4, 3,8e -5, 1.7e-4). Los gráficos de barras representan la media de n = 3 experimentos biológicamente independientes a menos que se indique lo contrario, y las barras de error indican intervalos de confianza del 95%. Los valores de P se calculan utilizando la prueba t independiente (bilateral).

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a, Esquema de la PCR cuantitativa de rango semilargo (SLR-qPCR) utilizada para detectar roturas de doble cadena (DSB). Dos conjuntos de cebadores, que producen un amplicón corto y otro largo, proporcionan datos que representan la cantidad total de plantilla (un control de normalización interno) y ADN no dañado, respectivamente. La densidad de DSB se mide utilizando ADN genómico de células no tratadas como referencia. El daño al ADN se calcula como DSB por 10 kb de ADN. b, Esquema del diseño del cebador SLR-qPCR alrededor del promotor y el cuerpo genético de genes seleccionados. c, Esquema para experimentos de bloques de replicación, se introdujo en las células de interés un sistema de plásmido dual que expresa dCas9 y un ARN guía dirigido a oriC. dCas9 previene la unión de proteínas de iniciación de replicación. Se indujo dCas9 con 200 ng/ml de aTc durante 30 minutos antes de añadir Rif. d,e, Número de DSB por 10 kilobases en el promotor fepA e ilvC medido usando SLR-qPCR después de 1 hora de tratamiento con 80ug/ml de rifampicina con o sin replicación (p = 1,5e-2, 7,6e-3, 9,9e- 4, 3.0e-4, 2.3e-3, 8.6e-3 de izquierda a derecha). La replicación se bloqueó usando dCas9 con un ARN guía dirigido al oriC durante 30 minutos antes de agregar rifampicina. f, medición por qPCR de la proporción oriC/ter de mutantes hipersensibles en el fondo de PC2 antes y después de cambiar las células a 42 °C, normalizada para replicar activamente células de tipo salvaje a 30 °C. Las células con una relación oriC/ter más baja se replican menos (n = 4; p = 9,3e-4, 1,9e-4, 4,8e-4). g, Eficiencia de recubrimiento de mutantes hipersensibles en PC2 a la temperatura permisiva de replicación de 30 ° C (p = 2,2e-4, 5,1e-5). Los gráficos de barras representan la media de n = 3 experimentos biológicamente independientes a menos que se indique lo contrario, y las barras de error indican intervalos de confianza del 95%. Los valores de P se calculan utilizando la prueba t independiente (bilateral).

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a, Agrupación de recuentos de expresión de ARN de mutantes rpoB con sensibilidad aumentada, disminuida o sin cambios hacia la biciclomicina y el 5-fluuracilo. Las células se cultivaron en LB y las muestras se recogieron en n = 3 réplicas biológicamente independientes. Los gráficos de volcanes del análisis de RNAseq se proporcionan en la figura complementaria 2. b, análisis de enriquecimiento GO de genes regulados diferencialmente en mutantes del sitio de unión de rifampicina en comparación con E. coli de tipo salvaje. Los valores de P se calculan utilizando la prueba exacta de Fisher unilateral con corrección de Benjamini-Hochberg.

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a, Expresión genética diferencial de las vías de biosíntesis de novo de pirimidina, recuperación de ribonucleótidos o recuperación de desoxirribonucleótidos en mutantes rápidos rpoB 515Y y 527W en comparación con el tipo salvaje, medido por RNAseq. Las diferencias estadísticamente significativas (p < 01) se muestran en azul. RNAseq se realizó en n = 3 réplicas biológicamente independientes y los valores de p bilaterales se calcularon utilizando la prueba de Wald con corrección de Benjamini-Hochberg. b, c, Eficiencia de recubrimiento de mutantes sensibles a 5-fluorouracilo en un fondo de pyrD o upp. Las células de cultivos nocturnos se diluyeron en serie y se sembraron en placas de agar LB con las concentraciones indicadas de 5FU en µg/ml. d, Purinas y dTDP en mutantes rpoB sensibles a 5-fluorouracilo detectados por LCMS (n = 5; p = 4.5e-5, 5.4e-1, 6.4e-3, 7.1e-3, 6.8e-1, 7.5e -2, 1.1e-3, 3.9e-1, 8.8e-1 de izquierda a derecha). e, Curvas de crecimiento de rpoB 515Y en comparación con células de tipo salvaje con la adición de 0, 0,1 o 1 µg/ml de timidina. Los valores representan la media de 2 réplicas biológicas. f, Eficiencia de recubrimiento de mutantes sensibles a 5-fluorouracilo en un fondo de thyA después de la inanición de timidina (p = 3,2e-3, 4,2e-3, 9,8e-3). g, eficiencia de recubrimiento de rpoB 513P con las concentraciones indicadas de 5FU en ug/ml (p = 7,2e-6). h, Eficiencia de recubrimiento de rpoB 513P en un fondo de thyA después de la inanición de timidina (p = 5,2e-4). Los diagramas de barras y las curvas de crecimiento representan la media de n = 3 experimentos biológicamente independientes a menos que se indique lo contrario, con barras de error que indican intervalos de confianza del 95%. Los valores de P se calculan utilizando la prueba t independiente (bilateral).

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a, Curvas de crecimiento de mutantes sensibles al 5-fluorouracilo cultivados a 25 °C. b, Curvas de crecimiento de mutantes rpoB estratificados por sensibilidad al 5-fluorouracilo a 25 ° C y 42 ° C. c, Curvas de crecimiento de células de tipo salvaje con biciclomicina subinhibitoria, cultivadas a 25 °C. Las curvas de crecimiento representan la media de n = 3 experimentos biológicamente independientes a menos que se indique lo contrario, con barras de error que indican intervalos de confianza del 95%. d, Diagramas de dispersión de conservación evolutiva y aptitud posicional promedio, resistencia o sensibilidad para cada posición de residuo. Se superponen líneas de regresión lineal y intervalos de confianza del 95%.

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Higos suplementarios. 1 y 2, que contienen la estrategia de activación para la Fig. 3 y gráficos de volcanes para datos de RNAseq relacionados con los datos extendidos de la Fig. 8, y las Tablas complementarias 1 a 5, que enumeran las cepas y los cebadores utilizados en el estudio.

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Reimpresiones y permisos

Yang, KB, Cameranesi, M., Gowder, M. et al. Paisaje de alta resolución de un sitio de unión de antibióticos. Naturaleza (2023). https://doi.org/10.1038/s41586-023-06495-6

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Recibido: 03 de agosto de 2022

Aceptado: 28 de julio de 2023

Publicado: 30 de agosto de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41586-023-06495-6

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