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Nov 28, 2023

Evaluación de cpn60 para alto

ISME Communications volumen 3, Número de artículo: 69 (2023) Cite este artículo 258 Accesos 3 Detalles de Altmetric Metrics A pesar de ser el marcador filogenético más utilizado para la elaboración de perfiles basados ​​en amplicones

Comunicaciones ISME volumen 3, Número de artículo: 69 (2023) Citar este artículo

258 Accesos

3 altmétrico

Detalles de métricas

A pesar de ser el marcador filogenético más utilizado para el perfilado de comunidades microbianas basado en amplicones, la resolución filogenética limitada del gen 16S rRNA limita su uso para estudios de coevolución huésped-microbio. Por el contrario, el gen cpn60 es un marcador filogenético universal con una mayor variación de secuencia capaz de resolución a nivel de especie. Esta investigación comparó los perfiles microbianos de la piel de los mamíferos generados a partir de enfoques de secuenciación de los genes cpn60 y 16S rRNA, probando patrones de filosimbiosis que sugieren asociaciones coevolutivas entre el huésped y el microbio. Se amplificó un fragmento de ~560 pb del gen cpn60 con cebadores universales y se sometió a secuenciación de alto rendimiento. La clasificación taxonómica de las secuencias de cpn60 se completó utilizando un clasificador QIIME2 bayesiano ingenuo creado para este proyecto, entrenado con una base de datos de cpn60 curada y complementada por el NCBI (cpnDB_nr). Luego, el conjunto de datos cpn60 se comparó con los datos publicados del amplicón del gen 16S rRNA. Las comparaciones de diversidad beta de los perfiles de comunidades microbianas generados con amplicones de los genes cpn60 y 16S rRNA no fueron significativamente diferentes, según el análisis de Procrustes de las distancias de Bray-Curtis y UniFrac. A pesar de relaciones similares entre los perfiles microbianos de la piel, la resolución filogenética mejorada proporcionada por la secuenciación del gen cpn60 permitió observaciones de filosimbiosis entre los perfiles de la comunidad microbiana y sus huéspedes mamíferos que no se habían observado previamente con los perfiles del gen 16S rRNA. La investigación posterior de los taxones de Staphylococcaceae utilizando el gen cpn60 mostró una mayor resolución filogenética en comparación con los perfiles del gen 16S rRNA, revelando posibles asociaciones coevolutivas entre el huésped y el microbio. En general, nuestros resultados demuestran que los genes marcadores 16S rRNA y cpn60 generan patrones de composición de comunidades microbianas comparables, mientras que cpn60 facilita mejor los análisis, como la filosimbiosis, que requieren una mayor resolución filogenética.

Las comunidades microbianas de la piel de los mamíferos tienen una influencia directa en la salud y la enfermedad del huésped y comparten una larga historia evolutiva con sus respectivos huéspedes. Se supone que las interacciones nutricionales y depredadoras iniciales entre los ancestros de las bacterias modernas y los eucariotas condujeron a la multicelularidad [1], y se desarrollaron aún más para incluir simbiosis metabólicas complejas [2] y respuestas inmunes innatas de los vertebrados [3, 4]. Dadas las variaciones en la fisiología [5], la cobertura del pelo y el pelaje [5, 6], el origen geográfico y las características del hábitat [7], y la historia evolutiva y las relaciones [8], el entorno de la piel de los mamíferos promueve casos de coevolución microbiana específica del huésped. . Debido a la heterogeneidad de nicho conferida por los mamíferos huéspedes, se cree que el ensamblaje de la comunidad microbiana de la piel es determinista (es decir, influenciado por factores ambientales o del huésped específicos) en lugar de estocástico (es decir, ensamblaje aleatorio y eventos de nacimiento y muerte) [9]. Para órdenes de mamíferos específicos, la evidencia microbiana demuestra que la filogenia del huésped se correlaciona con la composición de la comunidad microbiana, que se manifiesta como "filosimbiosis" [8].

La filosimbiosis es un patrón en el que la composición de la comunidad microbiana de un huésped refleja la historia ambiental y filogenética del huésped [10,11,12], y las especies de huéspedes más distantes muestran mayores diferencias en la composición de la comunidad microbiana en comparación con aquellas que están más estrechamente relacionadas [8 ]. El ensamblaje inicial de la comunidad microbiana a partir de procesos estocásticos o deterministas podría fomentar interacciones estrechas entre el huésped y la microbiota asociada a lo largo del tiempo, lo que podría conducir a relaciones coevolutivas y a un aumento de las asociaciones [12]. Utilizando el marcador filogenético del gen 16S rRNA, Ross et al. mostró la primera evidencia de filosimbiosis dentro de los órdenes Perissodactyla y Artiodactyla, que constituyen ungulados con dedos impares y pares, respectivamente, [8]. Su estudio también identificó un microbioma central común a todos los órdenes muestreados, representado por bacterias asociadas al suelo, como Agrobacterium y Arthrobacter, y taxones del género bacteriano común de la piel Staphylococcus [8, 13, 14], entre otros. Dentro de los primates, se identificó un microbioma axilar central que contiene Staphylococcus como un contribuyente dominante a la diversidad beta microbiana [5].

Los estudios de microbioma, como los mencionados anteriormente, utilizan con mayor frecuencia la secuenciación del gen del amplicón 16S rRNA de lectura corta debido a los costos asociados con la secuenciación completa del gen 16S rRNA y la metagenómica. Sin embargo, la “resolución” filogenética limitada del gen 16S rRNA, cuando se utiliza para secuenciación de lectura corta, da como resultado una clasificación de secuencia principalmente a nivel de género [15], lo que impide investigaciones detalladas de especies microbianas y poblaciones específicas, como Staphylococcaceae. Esta limitación a la resolución filogenética también puede enmascarar observaciones de filosimbiosis que quizás solo estén presentes en niveles taxonómicos más bajos. La investigación del microbioma de la piel de los mamíferos utilizando marcadores genéticos alternativos con mayor resolución filogenética, como cpn60 [16], podría revelar asociaciones clave entre microbio y huésped que pueden indicar relaciones coevolutivas existentes o futuras dentro de la clase Mammalia, con implicaciones para la salud de la piel de los mamíferos. y enfermedad.

Varias características del gen cpn60, conocido alternativamente como hsp60 y groEL, lo hacen útil para estudios de perfiles de comunidades microbianas de amplicones de lectura corta. El gen cpn60 es universal y codifica una proteína GroEL de 60 kDa que pertenece a una familia de chaperoninas de tipo I presentes en bacterias y cloroplastos, con chaperoninas de tipo II equivalentes que se encuentran en arqueas y eucariotas. Al igual que el gen 16S rRNA, la presencia de cpn60 y la función de GroEL son esenciales para la supervivencia celular y, por lo tanto, están presentes en toda la vida procariótica [17]. Sin embargo, a diferencia del gen 16S rRNA, solo una copia de cpn60 está presente en la mayoría de los genomas procarióticos [16]. Además, el gen cpn60 contiene una diversidad de secuencia mucho mayor en comparación con las regiones variables del gen 16S rRNA utilizadas en estudios de amplicones de lectura corta, con una mayor diversidad en la identidad de nucleótidos y mayores diferencias en la similitud de secuencia entre especies [16]. Además, los cebadores utilizados para amplificar la región “objetivo universal” 274–828 del gen cpn60 [16] producen un amplicón de ~554 pb de longitud. Aunque esta longitud excede la tecnología actual de secuenciación de alto rendimiento y lectura corta, solo se necesitan entre 150 y 250 bases de lectura directa para producir datos suficientes para la clasificación filogenética al nivel de especie [18], lo que permite su uso en las plataformas de secuenciación actuales ( ej., MiSeq, Illumina). Además, la reciente validación de la clasificación bayesiana ingenua utilizando el clasificador RDP demostró un alto grado de clasificación a nivel de especie utilizando secuencias de referencia cpn60 [19]. Debido a las características intrínsecas del gen cpn60, el desarrollo continuo de cebadores [20, 21] y bases de datos de referencia [22], la validación previa in silico e in situ [16, 18, 19] y el historial de uso tanto universal como dirigido. Estudios de perfiles microbianos [23,24,25,26,27,28,29], el gen cpn60 es un poderoso complemento del gen 16S rRNA como marcador filogenético universal dentro del contexto de la investigación de perfiles de comunidades microbianas y filosimbiosis/coevolución. del microbioma de la piel.

Al aprovechar la mayor resolución filogenética proporcionada por el gen cpn60, en combinación con variantes de secuencia de amplicones (ASV) capaces de identificar secuencias de amplicones individuales [30], la microbiota de la piel se puede perfilar y evaluar más a fondo en busca de patrones como la filosimbiosis y la coevolución. Además, la microbiota central asociada con la piel, como Staphylococcaceae, se puede perfilar con una mayor resolución filogenética similar a los enfoques de tipificación de secuencias de locus único o múltiple [31], equilibrando la alta especificidad y la detección universal de bacterias. Aunque estudios anteriores han utilizado el gen cpn60 para perfilar los microbiomas vaginales humanos [23,24,25] y de heces de cerdo [32], todavía se ha aplicado para perfilar el microbioma más amplio de la piel de los mamíferos. Este estudio utiliza perfiles microbianos comparativos de conjuntos de datos de genes de ARNr cpn60 y 16S emparejados para brindar apoyo adicional para el uso de cpn60 para perfilar la microbiota de la piel, confirmar informes anteriores de filosimbiosis en la piel de mamíferos [8] y presentar información novedosa sobre poblaciones microbianas específicas de piel y piel de mamíferos. sus posibles interacciones con sus respectivos anfitriones. Este estudio demuestra además cómo la base de datos cpn60, cpnDB [22], se puede integrar en el proceso completo de datos de secuencia microbiana QIIME2 para producir conjuntos de datos completos de amplicones del gen cpn60.

El ADN genómico de hisopos de piel de mamíferos se extrajo como parte de un estudio previo del gen 16S rRNA generado a partir de la amplificación de la región V3-V4 con los cebadores procarióticos universales Pro341F/Pro805R [8]. De estos, se eligió un subconjunto representativo de 95 muestras para la secuenciación basada en cpn60 y el perfil microbiano. Tanto la amplificación por PCR como la secuenciación de muestras de alto rendimiento se completaron en la Universidad de Saskatchewan como se describió anteriormente [20, 21]. El gen cpn60 se amplificó mediante PCR utilizando una mezcla de cebadores compuesta por M279 100 µM (5′ – GAIIIIGCIGGIGAYGGIACIACIAC – 3′), M280 (5′ – YKIYKITCICCRAAICCIGGIGC– 3′), M1612 (5′ – GAIIIIGCIGGYGACGGYACSACSAC– 3′) y M1613. (5′ – CGRCGRTCRCCGAAGCCSGGIGCCTT– 3′). Todos los cebadores contenían secuencias adaptadoras de Illumina en el extremo 5 '. Los cebadores se combinaron en una proporción molar de 1:3 de M279 y M280 (3 µl cada uno) y M1612 y M1613 (9 µl cada uno), luego se diluyeron en agua ultrapura hasta un volumen total de 300 µl. Todos los tubos y placas de PCR y el agua ultrapura utilizados para la PCR y la secuenciación se descontaminaron antes de su uso mediante exposición a luz ultravioleta durante 20 minutos. Se preparó una mezcla maestra de PCR utilizando 38,1 µl de agua ultrapura tratada con UV, 0,4 µl de Invitrogen Platinum Taq (ThermoFisher Scientific), 5 µl de tampón Thermopol 10X, 1 µl de dNTP 10 mM y 1 µl del cebador 1:3. cóctel para un volumen de reacción total de 50 l para 2 l de plantilla. Las condiciones de la reacción de amplificación fueron desnaturalización inicial a 95 °C durante 5 min, seguida de 40 ciclos de desnaturalización a 95 °C durante 30 s, hibridación a 60 °C durante 30 s, extensión a 72 °C durante 30 s y una extensión final. a 72°C durante 2 min. Todas las amplificaciones por PCR se visualizaron primero en un gel de bromuro de etidio al 1%, luego se extrajeron del gel y se purificaron usando perlas NucleoMag (Macherey-Nagel) como se describió anteriormente [21]. La biblioteca de amplicones purificada se secuenció mediante un ciclo de 401 × 101 utilizando TG MiSeq Reagent Nano Kit v2 (Illumina Canada, MS-103-1003) en un sistema MiSeq (Illumina).

Se utilizaron secuencias demultiplexadas para generar ASV utilizando QIIME2 versión 2019.10.0 [33, 34]. Solo las lecturas directas que contenían un amplicón de 400 nucleótidos de largo se importaron a QIIME2 y se truncaron a 200 nucleótidos usando DADA2 versión 2019.10.0 [35]. Luego se eliminaron las lecturas recortadas y se eliminaron las secuencias quiméricas antes de la generación de ASV utilizando DADA2. Se construyó un clasificador de taxonomía QIIME2 naïve-Bayes [33, 34] utilizando una combinación de secuencias de referencia de la base de datos de referencia cpnDB [22] y NCBI [36]. Se utilizaron secuencias representativas producidas a partir de DADA2 con nBLAST para consultar la base de datos de referencia no redundante y solo cultivada del NCBI, incorporando un umbral de valor e de 1e-6, utilizando Entrez Direct [37]. Los tres primeros resultados de cada consulta de secuencia se recopilaron para crear una base de datos que contiene 16.624 secuencias. Se eliminaron las entradas replicadas y las secuencias por debajo de 180 nucleótidos (4400) y las secuencias restantes (12224) se combinaron con cpnDB_nr (5489) para crear una base de datos final de 17713 secuencias de referencia del gen cpn60. Los linajes taxonómicos para las secuencias representativas se obtuvieron del NCBI utilizando los números de acceso de la secuencia de referencia y posteriormente se formatearon para integrarse en el entorno QIIME2.

Todas las secuencias de cpn60 generadas para el estudio actual se depositaron en el Archivo Europeo de Nucleótidos (ENA) con el número de acceso del proyecto PRJEB43503. Hay una tabla ASV cpn60 disponible en https://figshare.com/articles/dataset/cpn60_ASV_table/14955753.

Los genes de la citocromo oxidasa I (COXI) para el eland del Cabo, el burro, la cabra, el caballo, el babuino oliva, el caballo de Przewalski, la oveja, la hiena manchada y el orangután de Sumatra se obtuvieron de un estudio previo [8] y se utilizaron para construir un sistema basado en COXI para mamíferos. filogenia. Las secuencias del gen COXI de los mamíferos se alinearon utilizando ClustalW [38] en MEGA X versión 10.1.8 [39], con recorte y eliminación de espacios según corresponda. El modelo óptimo de sustitución de nucleótidos se determinó utilizando JModelTest2 versión 2.1.10 [40, 41]. Para el gen COXI de mamíferos, se construyó un dendrograma de máxima verosimilitud utilizando MEGA X con un modelo sustitucional GTR + G + I y con una evaluación de confianza de 1000 bootstraps. Luego se comparó la filogenia de los mamíferos con la literatura y se confirmó su exactitud.

Se generaron dendrogramas microbianos basados ​​en la composición de la comunidad utilizando secuencias del gen 16S rRNA obtenidas de un conjunto de datos de amplicones generado previamente [8] y las secuencias del gen cpn60 de este estudio actual. Para los dendrogramas microbianos del gen 16S rRNA y cpn60, las respectivas tablas de ASV se colapsaron en función del mamífero huésped y los recuentos de lecturas de ASV se sumaron para cada categoría. Las matrices de distancia Bray-Curtis, UniFrac no ponderada y UniFrac ponderada para las tablas ASV se generaron utilizando el comando de rarefacción beta de diversidad QIIME2, se enrarecieron a 1000 lecturas y se usaron para construir dendrogramas UPGMA con una evaluación de confianza de 1000 bootstraps.

Para comparar la composición de la comunidad microbiana entre los conjuntos de datos del gen 16S rRNA y cpn60, se realizaron análisis de Procrustes en ordenaciones de análisis de coordenadas principales (PCoA) generadas utilizando Bray-Curtis y métricas UniFrac ponderadas/no ponderadas. Las matrices de distancia se generaron utilizando el comando filogenético-métrico-central de diversidad de qiime2 y luego se exportaron con la exportación de herramientas de qiime. Los análisis de Procrustes se completaron en R usando el paquete vegano y el comando protest con 100.000 permutaciones y se trazaron usando ggplot.

Se compararon y evaluaron los dendrogramas del gen COXI de mamífero y del ARNr 16S microbiano y del gen cpn60 para determinar su congruencia utilizando los paquetes vegano, phangorn y ape en R como se describió anteriormente [8]. La filosimbiosis se evaluó con puntuaciones de Robinson-Foulds para los dendrogramas del gen 16S rRNA y cpn60 frente al dendrograma COXI de mamíferos. La importancia de la métrica de Robinson-Foulds se determinó comparando el dendrograma del gen COXI de mamíferos con 100.000 árboles generados aleatoriamente que contenían nodos terminales idénticos (es decir, taxones). La congruencia entre dendrogramas se midió con la puntuación de Robinson-Foulds normalizada, que oscila entre 0 y 1, donde 0 representa una congruencia perfecta. Los dendrogramas aleatorios se consideraron significativos si obtuvieron puntuaciones de Robinson-Foulds iguales o mayores que las obtenidas de las comparaciones entre los dendrogramas de la filogenia de los mamíferos y los genes microbianos (16S rRNA o cpn60).

Para investigar las comunidades microbianas de la piel de los mamíferos utilizando el gen cpn60, se seleccionaron 95 muestras representativas de hisopos de piel, ya extraídas para obtener ADN genómico y secuenciadas de un proyecto anterior [8], para una amplificación y secuenciación adicionales del gen cpn60. Este conjunto de datos de amplicones del gen cpn60 contenía muestras de 19 mamíferos únicos, con representación variable con respecto al número de muestras y proporciones de lectura (Tabla S1). De las 95 muestras enviadas para secuenciación, 88 muestras únicas contenían al menos una lectura, y la mayoría de las muestras estaban asociadas con menos de 500 lecturas en total. Las muestras de caballo y caballo de Przewalski representaron el 36,6% y el 25,4% de todas las lecturas secuenciadas del gen cpn60, respectivamente, seguidas por el babuino oliva (15,8%) y el eland del Cabo (10,0%). Todos los demás grupos de huéspedes de mamíferos contenían lecturas que representaban menos del 5% del total de lecturas del gen cpn60. Para evitar problemas de análisis posteriores relacionados con profundidades de muestreo poco profundas, se eliminaron todas las muestras con menos de 1000 lecturas, lo que resultó en un conjunto de datos final de 37 muestras (Fig. 1). Este subconjunto contribuyó con el 97,6% (118.645) de todas las lecturas del gen cpn60 (121.622). Aunque la pérdida de lectura general fue mínima, la representación de huéspedes mamíferos se redujo de 19 a 9: el eland del Cabo, burro, cabra, caballo, babuino oliva, caballo de Przewalski, oveja, hiena en maceta y orangután de Sumatra (Fig. 1).

El número medio de amplicones por huésped mamífero se indica con un cuadro.

La pérdida de representación del huésped mamífero debido a la poca profundidad de la secuenciación fue inesperada y podría tener una causa metodológica. La biomasa microbiana en la piel de los mamíferos es variable y puede ser comparativamente baja, siendo el muestreo de piel con hisopo seco el que produce la menor cantidad de biomasa en comparación con otros métodos [42]. Las muestras utilizadas en este estudio actual se recolectaron mediante el método de hisopo seco [8] y, por lo tanto, es probable que tengan una biomasa y un rendimiento de ADN asociados relativamente bajos. Además, las muestras tenían varios años (es decir, cuatro años en el momento de la secuenciación) y se almacenaron a -20 °C en lugar de los -80 °C recomendados para muestras de hisopos de piel [42]. Combinados, estos factores pueden haber afectado la integridad del ADN genómico y las plantillas de cpn60 asociadas, y la profundidad de secuenciación posterior. El gen cpn60 en sí tiene un número medio de copias de una por genoma [16] y, por lo tanto, las muestras podrían ser más susceptibles a la degradación del ADN que afecta la amplificación objetivo. Las investigaciones futuras de comunidades específicas del microbioma de la piel de los mamíferos que utilizan el gen cpn60 se beneficiarían del uso de ADN genómico extraído recientemente de muestras de piel de mamíferos, idealmente utilizando hisopos húmedos o cinta adhesiva para aumentar la recolección de biomasa [42].

A pesar de una reducción en la representación del huésped, la secuenciación basada en cpn60 proporcionó información valiosa sobre el microbioma de la piel de los mamíferos. Las muestras de babuino oliva contenían perfiles microbianos distintos y comparativamente uniformes (Fig. 2). Estos perfiles estuvieron representados por Prevotella, Prophyromonas y Butyricicoccus, que fueron los más abundantes en las muestras de babuinos oliva. Las muestras de eland del Cabo, caballo y caballo de Przewalski tuvieron perfiles microbianos menos consistentes entre las muestras. Las muestras de eland del Cabo contenían secuencias asociadas con Jeotgalicoccus que se compartían entre las muestras de cabras, caballos y ovejas. Para las muestras de caballos, los perfiles microbianos fueron variables entre las muestras y contenían secuencias únicas asociadas a caballos con Moraxella. Los perfiles microbianos de las muestras de caballos de Przewalski eran más uniformes y contenían secuencias afiliadas a Planomicrobium y Macrococcus; Estos taxones estaban casi ausentes en otros perfiles microbianos del huésped mamífero. De los huéspedes mamíferos con representación de muestra única, los perfiles microbianos del orangután de Sumatra incluyeron más géneros únicos (nueve) que el burro (cuatro), la cabra (dos), la oveja (cero) y la hiena manchada (una). En todas las muestras, las secuencias asociadas a Corynebacterium dominaron y estuvieron representadas en una abundancia relativa moderada (>5%) en la cabra, el caballo, el babuino oliva, el caballo de Przewalski y la oveja, aunque en algunos casos representaron hasta el 75% de la comunidad total. Las secuencias afiliadas a Acidobacteria también estaban presentes en el burro, el caballo, el babuino oliva y el caballo de Przewalski en abundancias relativas que oscilaban entre el 4 y el 38%. Las secuencias más observadas pertenecían a bacterias no clasificadas (Bacteria_394), que estaban presentes en 35 de las 37 muestras en alta abundancia, así como a una Proteobacteria no resuelta (Proteobacteria_383) en 30 de las 37 muestras.

Los ASV generados se colapsaron al nivel de género y se filtraron a >3% de abundancia relativa. Los tamaños de las burbujas representan la abundancia relativa de taxones en cada muestra. Los taxones no resueltos a nivel de género se etiquetaron según su siguiente nivel taxonómico resuelto.

Las comparaciones con el conjunto de datos del gen 16S rRNA previamente clasificado mostraron inconsistencias entre los perfiles taxonómicos (Fig. 3, Tabla S2). Aunque los diferentes marcadores genéticos estarán sujetos a diversos sesgos, como el número de copias del gen [43, 44], el contenido de GC de nucleótidos [45, 46], la región objetivo y los cebadores utilizados para la amplificación [47, 48] y ciertas proporciones bacterianas [49] , la causa principal de la disimilitud en los perfiles taxonómicos es la base de datos de referencia separada utilizada para cada conjunto de datos. La disponibilidad de bases de datos de referencia del gen cpn60 seleccionadas es limitada. La única base de datos cpn60 mantenida actualmente es cpnDB [22], que en el momento de realizar este estudio contenía ~7000 secuencias en su base de datos no redundante. Aunque esto se incrementó a 17.713 secuencias combinándolo con los resultados de BLAST de nucleótidos, el cpnDB es superado con creces por la base de datos del gen SILVA 138.1 16S rRNA, que contiene más de 510.000 secuencias de referencia no redundantes [50]. Una gran proporción de las lecturas del gen cpn60 fueron bacterias no clasificadas o permanecieron sin resolver hasta el nivel de género en comparación con los datos del gen 16S rRNA (Tabla S2). Un aumento en la cobertura de la base de datos del gen cpn60 mejoraría la clasificación y facilitaría las comparaciones directas de taxonomía entre perfiles microbianos generados a partir de marcadores filogenéticos separados.

Los ASV se colapsaron al nivel de género y se filtraron a >5% de abundancia relativa. Los tamaños de las burbujas representan la abundancia relativa de taxones en cada muestra. Los taxones no resueltos a nivel de género se etiquetaron según su siguiente nivel taxonómico resuelto.

Además de la cobertura limitada de la base de datos, las comparaciones directas de perfiles taxonómicos entre dos marcadores filogenéticos requieren que los ASV se colapsen en niveles taxonómicos (por ejemplo, género o especie), lo que depende de la estructura taxonómica de la propia base de datos. Por mucho que los ASV con una única diferencia de nucleótidos puedan interpretarse como un ASV único, los linajes taxonómicos que difieren en tan solo un carácter se clasificarán como taxones separados dentro de QIIME2. En este estudio, al conjunto de datos del gen 16S rRNA se le asignó una taxonomía utilizando la base de datos SILVA [50, 51], que obtiene su información taxonómica de una combinación de fuentes, incluidas NCBI y GTDB [52], y se somete a anotaciones manuales adicionales. Por el contrario, la cpnDB no mantiene actualmente una base de datos de referencia de taxonomía. En cambio, al conjunto de datos del gen cpn60 se le asignó una taxonomía basada en una base de datos de taxonomía derivada del NCBI generada para este estudio como requisito para la implementación en el QIIME2. Como tal, las diferencias entre los perfiles de los genes cpn60 y 16S rRNA pueden haberse visto afectadas por taxonomías incongruentes entre las bases de datos y pueden no reflejar con precisión las verdaderas diferencias. Por ejemplo, en los datos estaban presentes dos clasificaciones de Corynebacterium (es decir, Corynebacterium_93 y Corynebacterium1_94) (Fig. 3). Un colapso exitoso al nivel de género debería haber colocado a los ASV asociados en un único género común de Corynebacterium. En este caso, la diferencia es la inclusión de un “1” al final del linaje Corynebacterium dentro del archivo de taxonomía del gen 16S rRNA. De manera similar, Massilia se separa en Massilia_1203 y Massilia_1347 (datos no mostrados). Aquí, las diferencias son el resultado de una clasificación taxonómica superior: Massilia ha sido reclasificada en la clase Gammaproteobacteria dentro de la taxonomía de ARNr 16S basada en GTDB [52], mientras que la taxonomía NCBI y la base de datos SILVA actualmente mantienen el linaje de clase Betaproteobacteria original. Como tal, los ASV asociados con el mismo género se enumeran como dos taxones separados en lugar de uno, y la diferencia es “invisible” a nivel de género. Si el gen cpn60 continúa utilizándose como marcador filogenético alternativo al gen 16S rRNA, así como implementado dentro del entorno QIIME2, es importante que se cree una base de datos de taxonomía de referencia que contenga linajes taxonómicos compatibles con la base de datos SILVA (u otra base de datos a la que se acceda habitualmente). bases de datos) se mantendrán junto con cpnDB para que se puedan realizar comparaciones directas. Alternativamente, anteriormente se ha utilizado una combinación de alineamientos BLAST y Smith-Waterman (watered-BLAST) para asignar taxonomía a conjuntos de datos del gen cpn60 [25], aunque este método también utiliza la base de datos de taxonomía NCBI y estaría sujeto a los mismos problemas de incompatibilidad taxonómica. .

Los datos del microbioma generados a partir de dos marcadores filogenéticos procarióticos universales separados deberían, idealmente, producir perfiles de composición similares, a pesar de cualquier diferencia en la clasificación taxonómica. Se utilizaron análisis de PCoA y Procrustes para comparar la diferencia en la composición de la comunidad microbiana entre los conjuntos de datos de los genes cpn60 y 16S rRNA, independientemente de las clasificaciones taxonómicas y el sesgo impartido por las bases de datos de referencia elegidas. Las ordenaciones producidas a partir de ambos conjuntos de datos mostraron correlaciones significativas (p <0,05), con coeficientes de correlación de 0,91, 0,69 y 0,66 para Bray-Curtis, UniFrac ponderado y UniFrac no ponderado, respectivamente (Fig. 4). Las composiciones de las muestras de babuino oliva fueron distintas, y las muestras se agruparon por separado de otros huéspedes mamíferos para cada métrica analizada. Las muestras del caballo de Przewalski y del eland del Cabo también se agruparon con sus respectivos huéspedes, y todas las demás muestras se agruparon homogéneamente entre los mamíferos huéspedes para cada métrica de diversidad analizada.

Los triángulos (puntas de flecha) y las líneas de conexión indican el cambio en el espacio de ordenación de muestras entre conjuntos de datos. Los análisis se completaron con 100.000 permutaciones para calcular la significancia.

Debido a que Bray-Curtis solo tiene en cuenta los datos de presencia y abundancia, una alta correlación de la métrica de Bray-Curtis indica que los conjuntos de datos de los genes cpn60 y 16S rRNA contienen una proporción y distribución similar de taxones dentro de sus respectivas muestras. La inclusión de datos filogenéticos (es decir, UniFrac) puede desenmascarar diferencias potenciales con respecto a la relación con ASV y proporcionar información sobre si la composición de la comunidad microbiana entre los conjuntos de datos de los genes cpn60 y 16S rRNA es comparable. De hecho, las correlaciones más débiles observadas utilizando las métricas de UniFrac podrían indicar que el amplicón del gen cpn60 proporciona información filogenética adicional que la región V3-V4 del gen 16S rRNA no puede. Como el fragmento V3-V4 del gen 16S rRNA a menudo carece de suficiente diversidad de nucleótidos para resolver especies con confianza [15], las métricas de diversidad que dependen de la resolución filogenética serán igualmente limitadas. Por el contrario, los amplicones del gen cpn60 contienen suficiente información filogenética para resolver especies e irradiar árboles filogenéticos subyacentes [18, 53, 54, 55, 56]. Validaciones adicionales que utilizan un subconjunto de este conjunto de datos actual respaldan que los amplicones del gen cpn60 resuelven más claramente los taxones a nivel de especie en comparación con los amplicones del gen 16S rRNA (Fig. S1). Las diferencias en la resolución influirán en las mediciones de disimilitud, lo que dará como resultado cambios en la similitud de las muestras observadas y, en última instancia, diferencias en la correlación de Procrustes entre conjuntos de datos. Específicamente para la métrica UniFrac no ponderada, la resolución filogenética proporcionada por el gen cpn60 tendría un impacto considerable porque la resolución de taxones de ramas poco profundas contribuye con casi el 90% de la distancia de la muestra [53], lo que resulta en correlaciones más bajas. Para el UniFrac ponderado, los taxones de ramas profundas son en gran medida responsables de las distancias de muestra [53] y, por lo tanto, deberían verse menos influenciados por un aumento en la resolución filogenética a menos que resulte en cambios en la topología de las ramas profundas (es decir, cambios de filo o nivel de clase). . No obstante, todas las pruebas de Procrustes (Fig. 4) indican que las composiciones de la comunidad microbiana generadas a partir de conjuntos de datos de genes cpn60 y 16S rRNA son significativamente similares entre sí y pueden usarse para llegar a conclusiones similares con respecto al microbioma y la filosimbiosis asociados al huésped mamífero.

La resolución filogenética proporcionada por el gen marcador cpn60 debería permitir observaciones adicionales de las asociaciones huésped-microbio, particularmente si esas asociaciones se encuentran en niveles taxonómicos más finos. Los patrones de filosimbiosis dentro de los perfiles microbianos del amplicón del gen cpn60 y 16 S rRNA se evaluaron comparando los dendrogramas de composición de la comunidad microbiana con un dendrograma de mamíferos COXI que representa la historia filogenética de los mamíferos. Se observaron patrones significativos (p = 6,73 × 10−3) de filosimbiosis en el dendrograma microbiano de Bray-Curtis del gen 16S rRNA para clados que contienen el eland del Cabo, la cabra y la oveja (Artiodactyla) y el burro, el caballo de Przewalski y el caballo (Perissodactyla). ), aunque estas observaciones no fueron significativas para el dendrograma microbiano basado en cpn60 (Fig. 5). Por el contrario, se observaron resultados significativos para el amplicón del gen cpn60 no ponderado (p = 4,36 × 10−2) y ponderado (p = 4,43 × 10−2) dendrogramas microbianos UniFrac para Artiodactyla (excluido Cape eland) y Perissodactyla, pero no dentro del Dendrogramas basados ​​en el gen 16S rRNA. No hubo evidencia de filosimbiosis para los primates (babuino oliva y orangután de Sumatra) y carnívoros (hiena manchada). Estas observaciones confirman además que las comunidades microbianas de Perissodactyla y Artiodactyla están influenciadas por la historia evolutiva del huésped, como se observó anteriormente utilizando el gen 16S rRNA [8]. Debido a que los mamíferos huéspedes incluidos en el estudio variaron en ubicación y edad, y están potencialmente más influenciados por microorganismos "ambientales", los patrones de filosimbiosis podrían enmascararse cuando se incluyen mamíferos de múltiples órdenes de mamíferos juntos para el análisis [8]. Este estudio actual se basa en muestras obtenidas originalmente de la misma publicación, por lo que factores de confusión similares también pueden influir en las observaciones actuales y se han abordado previamente [8]. No obstante, los dendrogramas microbianos basados ​​en cpn60 produjeron resultados de filosimbiosis significativos y congruentes para Artiodactyla y Perissodactyla utilizando medidas UniFrac, sin necesidad de aislarlos de otros órdenes de mamíferos, como se realizó anteriormente [8]. El hecho de que las métricas UniFrac basadas en filogenética produjeron resultados de filosimbiosis significativos solo con los perfiles microbianos basados ​​en cpn60 sugiere que la resolución filogenética proporcionada por el gen cpn60 revela diferencias de composición sutiles y desenmascara patrones de filosimbiosis no observados en el conjunto de datos del gen 16S rRNA. Sin embargo, la representación del huésped mamífero es limitada en este estudio actual, y la inclusión de muestras adicionales podría resultar en un nuevo enmascaramiento de los patrones de filosimbiosis.

Los cuadrados azules indican clados idénticos entre la filogenia de los mamíferos y el dendrograma microbiano. Se probó la importancia de la congruencia utilizando una medida de Robinson-Foulds normalizada (nRF) que oscila entre 0 y 1, donde 0 representa una congruencia perfecta. Las observaciones importantes de congruencia de árboles se indican con un “*”.

Un beneficio propuesto del uso del gen cpn60 para la elaboración de perfiles de microbioma es la capacidad de detectar y resolver universalmente poblaciones microbianas específicas y sus asociaciones con un entorno o huésped. Para probar esta ventaja, se seleccionó la familia Staphylococcaceae para análisis adicionales, dada la ubicuidad de taxones afiliados entre los huéspedes mamíferos [8] y la relevancia de ciertos miembros para la salud y las enfermedades de la piel. De las 37 muestras, 33 (89%) contenían lecturas asociadas a Staphylococcaceae. La proporción de lecturas asociadas con Staphylococcaceae varió entre los huéspedes mamíferos y osciló entre 0,08% (2/2307 lecturas) y 26,0% (1339/5142 lecturas), con la mayoría de las muestras (23/33, 69,9%) por debajo del 10% de abundancia relativa (Fig. .6). La muestra de hiena manchada no contenía lecturas asociadas a Staphylococcaceae y, por lo tanto, se eliminó de análisis posteriores. Las muestras de babuino oliva y orangután de Sumatra contenían la menor cantidad de lecturas asociadas con Staphylococcaceae, y ninguna muestra superó el 1% de abundancia relativa. La distribución de especies específicas de Staphylococcaceae varió entre los mamíferos huéspedes. Las lecturas asociadas con Jeotgalicoccus halophilus estuvieron presentes en todos los huéspedes mamíferos, excepto el burro y el caballo de Przewalski, y las especies de Staphylococcaceae no resueltas estuvieron igualmente presentes, aunque ausentes en el caballo de Przewalski y el orangután de Sumatra. Para las muestras de caballos de Przewalski, Macrococcus carouselicus fue la especie de Staphylococcaceae predominante en la mayoría de las muestras, seguida por Macrococcus equipercicus, que estuvo ausente en las muestras de caballos. Las muestras del caballo y del caballo de Przewalski contenían especies de Salinicoccus, pero por lo demás tenían una superposición mínima entre los huéspedes. Las muestras de caballos fueron las más variables y se superpusieron entre muchos otros huéspedes mamíferos, aunque contenían secuencias asociadas únicamente con Staphylococcus fleurettii, Salinicoccus halodurans y Macrococcus brunensis. Las muestras de eland del Cabo contenían poblaciones de Staphylococcaceae que se dividían uniformemente entre Staphylococcaceae no resueltas y Jeotgalicoccus halophilus.

Los taxones resueltos a nivel de especie se indican en azul. Los tamaños de las burbujas representan la abundancia relativa de taxones específicos en cada muestra, calculada a partir del número total de lecturas de Staphylococcaceae. La proporción de lecturas de Staphylococcaceae en el conjunto de datos del amplicón del gen cpn60 se indica para cada muestra en el gráfico de barras inferior.

Las comparaciones realizadas entre los perfiles de Staphylococcaceae del amplicón del gen cpn60 y 16S rRNA muestran una clasificación de especies mejorada de las poblaciones de Staphylococcaceae cuando se utiliza el gen cpn60 (Fig. 6, Fig. S1). La mayoría de los perfiles producidos utilizando el gen 16S rRNA contenían grandes abundancias relativas de secuencias de Staphylococcaceae no resueltas, con sólo dos especies resueltas presentes en el conjunto de datos (es decir, Macrococcus brunensis y Salinicoccus roseus). En comparación, los perfiles del gen cpn60 contenían principalmente poblaciones resueltas por especies, con pocas excepciones. El beneficio de una resolución filogenética mejorada es más evidente para las muestras de caballos de Prezwalski, en las que la mayoría de las secuencias asociadas a Staphylococcaceae se resolvieron en Macrococcus carouselicus o Macrococcus equipercicus entre el gen 16S rRNA y el conjunto de datos del gen cpn60. La distribución y abundancia relativa de estos taxones, en combinación con observaciones previas de filosimbiosis en Perissodactyla, sugiere una especificidad de huésped para los caballos de Przewalski y una posible influencia coevolutiva. El caballo de Przewalski se considera un verdadero caballo “salvaje”, ya que no ha sido domesticado y está relativamente aislado en las estepas asiáticas [57], aunque estas muestras actuales provienen del zoológico de Toronto (Ontario, Canadá). El entorno de la piel de los caballos de Przewalski podría diferir del de los caballos domesticados comunes incluidos en este estudio y, por lo tanto, podría influir en el ensamblaje de la comunidad microbiana. Es importante destacar que, aunque los caballos incluidos en este análisis fueron cepillados regularmente (es decir, diariamente o semanalmente), los caballos de Przewalski no fueron cuidados. Como tal, la población de Staphylococcaceae observada en los caballos de Przewalski podría representar una población más "natural", en contraste con los caballos domesticados donde su microbiota se ve continuamente perturbada por la interacción humana. Las diferencias o alteraciones en las poblaciones de Staphylococcaceae en el caballo de Prezewalski y el caballo domesticado podrían afectar la susceptibilidad del huésped a las enfermedades dado que Staphylococcaceae tiene fuertes asociaciones en el desarrollo de la dermatitis de la cuartilla equina [58].

El representante resuelto más destacado de Staphylococcaceae afiliado al conjunto de datos cpn60 fue Jeotgalicoccus halophilus. El conjunto de datos comparable del gen 16S rRNA [8] también contiene el género Jeotgalicoccus con proporciones similares para el eland del Cabo y varias muestras de caballos, aunque la mayoría de las secuencias afiliadas a Staphylococcaceae pertenecen al género Macrococcus (83,7%). Ninguno de los ASV asociados a Jeotgalicoccus dentro del conjunto de datos del gen 16S rRNA se resolvió en J. halophilus. El género Jeotgalicoccus se aisló originalmente de un marisco fermentado tradicional coreano [59], y otros representantes se capturaron en forma de aerosoles en granjas de cerdos [60] y pavos [61]. Específicamente, J. halophilus se aisló por primera vez en un lago salado [62] y desde entonces se ha detectado como una bacteria transmitida por el aire en criaderos [63] y en asociación con corales marinos [64]. Al momento de escribir este artículo, no existe literatura adicional que mencione J. halophilus en asociación con la piel de mamíferos, aunque esto no excluye su detección previa. La consulta de la base de datos NCBI arrojó secuencias obtenidas de estudios ambientales mencionados anteriormente, pero también incluyó un estudio de mastitis bovina en el que se detectó J. halophilus [65].

Aunque Jeotgalicoccus se detectó previamente en la piel de mamíferos utilizando el gen 16S rRNA [8], el gen cpn60 ha permitido la resolución de J. halophilus de otras especies presentes en la misma. Dentro de los primates, J. halophilus representa la totalidad de las lecturas asociadas de Staphylococcaceae (Fig. 6), aunque esto se debe a la baja profundidad de lectura de Staphylococcaceae. Sin embargo, las muestras de eland del Cabo tienen una profundidad de lectura de Staphylococcaceae considerablemente mayor, y J. halophilus representa al menos la mitad del total de lecturas, y es el taxón predominante por especie. De manera similar, la muestra de ovejas, que contenía la mayor proporción de lecturas asociadas a Staphylococcacea, también tenía una alta proporción de J. halophilus, lo que sugiere que la abundancia relativa y la prevalencia de este taxón no es un artefacto de una profundidad de lectura limitada. Además, dada su ausencia en varias muestras y dos huéspedes mamíferos (es decir, burro y caballo de Przewalski), así como en los controles, es poco probable que se trate de un contaminante cruzado introducido desde el laboratorio durante la extracción y el procesamiento de la muestra.

Se desconoce la importancia o el papel de J. halophilus en el contexto de la piel de los mamíferos. Como anaerobio facultativo con requisitos metabólicos básicos, un rango de crecimiento de 4 a 40 °C y una tolerabilidad a la sal del 0,1 al 16 % p/v [62], está bien adaptado para sobrevivir en la piel de los mamíferos. Además, es coagulasa y oxidasa positiva y resistente a varios antibióticos naturales [62], lo que podría indicar su capacidad para actuar como un patógeno oportunista. Es difícil sacar conclusiones sobre la influencia de las Staphylococcaceae asociadas al huésped detectadas con respecto a la función, la salud y la enfermedad de la piel. Por ejemplo, Staphylococcus fleuretti, encontrado en una sola muestra de caballo, es un organismo coagulasa negativo asociado con diversas enfermedades animales y se ha indicado que contribuye a la resistencia a la meticilina en el medio ambiente [66]. Sin embargo, el caballo del que se tomó la muestra en este estudio actual no tenía problemas de salud de la piel, aunque sí tenía una infección respiratoria leve [8]. Incluso patógenos bien establecidos, como S. aureus o S. epidermidis, pueden existir en estados no patológicos dentro del microbioma de la piel y solo causan patología cuando se rompe la barrera cutánea o cuando se altera la comunidad [67, 68]. Por lo tanto, la detección de géneros o especies asociados a enfermedades en la piel de los mamíferos sólo puede proporcionar una visión limitada de la dinámica huésped-microbio. En última instancia, se necesita más trabajo para caracterizar mejor las interacciones que estas especies microbianas podrían tener con sus huéspedes mamíferos. De todos modos, el hecho de que estos Staphylococcus spp. se han detectado en la piel de mamíferos demuestra el potencial de cpn60 para resolver especies de clasificaciones de género vagas y para su aplicación en perfiles universales de alta resolución del microbioma de la piel de los mamíferos.

Se demostró que los perfiles microbianos de la piel de mamíferos generados utilizando el gen marcador cpn60 son comparables con los conjuntos de datos del gen 16S rRNA y respaldan observaciones previas de filosimbiosis basadas en el gen 16S rRNA. Se observó evidencia de filosimbiosis en los órdenes de mamíferos Perissodactyla y Artiodactyla utilizando el conjunto de datos de amplicones del gen cpn60 y la métrica de distancia UniFrac basada en filogenia; esta evidencia estuvo ausente en el conjunto de datos del amplicón del gen 16S rRNA. Resolver especies dentro de clasificaciones de género vagas proporciona información sobre la distribución, presencia y posible influencia de taxones específicos asociados al huésped y su influencia en la salud y la enfermedad de la piel. El conjunto de datos del amplicón del gen cpn60 reveló asociaciones no observadas previamente entre huéspedes mamíferos y taxones específicos, como Jeotgalicoccus halophilus, que de otro modo no habrían sido detectados. La amplificación del gen cpn60 no excluye comunidades bacterianas específicas sobre otras (p. ej., cebadores específicos de arqueas o de especies) y, por lo tanto, puede usarse tanto para la comunidad microbiana completa como para la elaboración de perfiles específicos de especies. Aunque es probable que el gen 16S rRNA siga siendo el marcador filogenético utilizado predominantemente para estudios basados ​​en amplicones, el gen cpn60 es complementario a los estudios de microbioma donde se desea una resolución taxonómica universal de bajo nivel. Sin embargo, si se van a comparar los estudios de amplicones cpn60 con los producidos utilizando el gen 16S rRNA, es imperativo que se mantenga una base de datos de taxonomía estandarizada junto con la base de datos de referencia de secuencias cpnDB. Este estudio integró cpnDB en el entorno QIIME2 utilizando la base de datos de taxonomía NCBI, lo que permitirá un análisis más rápido de los conjuntos de datos de amplicones del gen cpn60 en el futuro. Sin embargo, en lugar de una base de datos de taxonomía separada, el progreso hacia la integración del cpnDB con las bases de datos de taxonomía existentes, como SILVA [50, 51] o el proyecto de base de datos ribosomal [69] facilitaría la investigación futura basada en cpn60 y mejoraría la asignación taxonómica, tanto dentro como fuera del país. y externo al entorno QIIME2.

Todos los datos generados durante este estudio actual están disponibles en el repositorio del Archivo Europeo de Nucleótidos (ENA) con el número de acceso del proyecto PRJEB43503. La tabla completa de cpn60 ASV utilizada para este estudio está disponible en https://figshare.com/articles/dataset/cpn60_ASV_table/14955753.

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Esta investigación fue apoyada por una Beca Discovery del Consejo de Investigación en Ingeniería y Ciencias Naturales de Canadá (NSERC).

Departamento de Biología, Universidad de Waterloo, Waterloo, Ontario, Canadá

Alexander K. Umbach y Josh D. Neufeld

Departamento de Microbiología Veterinaria, Universidad de Saskatchewan, Saskatoon, Saskatchewan, Canadá

Sra. Ferdinand y Janet E. Hill

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Correspondencia a Josh D. Neufeld.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Umbach, AK, Fernando, C., Hill, JE et al. Evaluación de cpn60 para perfiles de alta resolución del microbioma de la piel de mamíferos y detección de filosimbiosis. COMUN ISME. 3, 69 (2023). https://doi.org/10.1038/s43705-023-00276-y

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Recibido: 20 de marzo de 2023

Revisado: 19 de junio de 2023

Aceptado: 21 de junio de 2023

Publicado: 07 de julio de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s43705-023-00276-y

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