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Jul 01, 2023

Una novela, baja.

Scientific Reports volumen 13, Número de artículo: 12084 (2023) Citar este artículo 278 Accesos Detalles de métricas La detección rápida y precisa de la carga biológica se ha vuelto cada vez más necesaria para la alimentación, la salud,

Scientific Reports volumen 13, número de artículo: 12084 (2023) Citar este artículo

278 Accesos

Detalles de métricas

La detección rápida y precisa de la carga biológica se ha vuelto cada vez más necesaria para aplicaciones alimentarias, sanitarias, farmacéuticas y medioambientales. Para detectar la carga biológica con precisión y de forma muy sensible, hemos fabricado un novedoso dispositivo de microfluidos con un filtro integrado para atrapar las células. La carga biológica se detecta en el papel de filtro in situ mediante la reacción redox de resorufina con etiqueta fluorescente y se utiliza un fluorómetro multicanal portátil para medir la fluorescencia. El dispositivo de microfluidos se fabricó de forma sencilla, económica y rápida con unión asistida térmicamente inducida por microondas. Para caracterizar la calidad de unión de los casetes de microfluidos, se realizaron diferentes pruebas y se optimizó el material y el tamaño del papel de filtro. Se filtraron muestras bacterianas del cultivo primario de Bacillus subtilis a través del dispositivo para validar e investigar los parámetros de rendimiento. Nuestros resultados muestran que se puede lograr un límite de detección (LOD) de 0,037 UFC/ml a través de este dispositivo de microfluidos, mientras que el LOD en un casete de microfluidos normal en el fluorómetro y el espectrofotómetro estándar de oro son 0,378 y 0,128 UFC/ml respectivamente. Los resultados muestran que es posible mejorar el LOD de tres a diez veces a través de este casete de microfluidos y es posible una detección más sensible dependiendo del volumen filtrado en tan solo 3 minutos. Este novedoso dispositivo de microfluidos junto con el fluorómetro se puede utilizar como una herramienta portátil rápida para la detección bacteriana altamente sensible, precisa y de alto rendimiento para diferentes aplicaciones.

Millones de personas enferman y mueren cada año a causa de la contaminación de alimentos, agua o medicamentos1. Según la Organización Mundial de la Salud2, una carga mundial de morbilidad del 45% se atribuye a la carga biológica. En la fabricación de productos biofarmacéuticos, la contaminación asociada con la carga biológica también es una preocupación importante3. Como resultado, los dispositivos de diagnóstico se han vuelto cada vez más importantes para identificar bacterias y su susceptibilidad a los antibióticos4,5. Para la detección de cargas biológicas, existen muchos métodos analíticos disponibles: bioluminiscencia de trifosfato de adenosina6, citometría de flujo7, amplificación de ácidos nucleicos8, respiración7, métodos de impedancia8 y detección de anticuerpos7, por mencionar sólo algunos. La mayoría de las técnicas de detección requieren un tiempo relativamente largo para detectarse (de 3 h a 7 días)9. Además, cuando las tasas de detección son lo suficientemente rápidas, el costo y la sensibilidad se convierten en limitaciones10,11,12. Actualmente, los ensayos de viabilidad celular se utilizan a menudo en el desarrollo de fármacos para estudiar factores de crecimiento, citoquinas y agentes citotóxicos que son capaces de detectar rápidamente células y bacterias viables. En los últimos años, la resazurina se ha utilizado en mediciones de viabilidad celular para medir la oxidación-reducción de una muestra determinada. Para detectar la carga biológica de forma rápida y sensible, nuestro estudio anterior13 demostró el uso de un fluorómetro portátil alimentado por USB para detectar células viables en una muestra determinada basándose en la detección de resorufina de alto rendimiento cuántico a partir de resazurina. En este sistema de bajo costo, la pendiente de la intensidad de la fluorescencia sirvió como criterio para detectar la carga biológica. Las células viables se controlaron utilizando el colorante indicador redox resazurina. A la muestra bajo investigación se le añadió resazurina y se cargó en un casete de microfluidos de diseño especial y se observó la tasa de cambio de resazurina a resorufina mediante el fluorómetro. Para detectar la carga biológica con mayor sensibilidad, en este estudio se presenta un nuevo dispositivo de microfluidos con un filtro integrado para filtración y detección automatizadas con el fluorómetro y el ensayo informados.

La microfluídica se ha convertido en una tecnología poderosa en las últimas décadas y ha encontrado aplicaciones en varias áreas de investigación de vanguardia que incluyen química analítica14, productos farmacéuticos15, síntesis de sustancias químicas16 y aplicaciones clínicas17,18. Recientemente, las tecnologías de microfluidos también se han aplicado a estudios de microorganismos. Los dispositivos de microfluidos con escala micro e integración a gran escala ofrecen muchas ventajas especiales que incluyen bajo costo, mayor rendimiento y mayor eficiencia en el análisis de microorganismos19,20,21,22,23 y la persistencia de antibióticos24. Los desarrollos recientes en microfluidos también utilizan papel de filtro como medio para atrapar y detectar bacterias y se están volviendo populares debido a su bajo costo, facilidad de acceso, procesamiento, modificación y eliminación25,26. Sin embargo, los dispositivos de microfluidos en papel informados tienen un límite de detección (LOD) muy alto que oscila entre 57 y 500 UFC/ml y una precisión baja27,28,29,30. Los dispositivos a menudo requieren modificaciones complejas, es decir, funcionalización de anticuerpos, inmovilización de nanopartículas y curado UV para patrones en el papel de filtro para la detección27,28,29,30. Además, los dispositivos suelen ser específicos para una determinada cepa de detección bacteriana debido a cierta funcionalización de anticuerpos27,28,29,30. Estos inconvenientes impiden que los dispositivos de microfluidos basados ​​en papel de filtro, rápidos, sencillos y de bajo costo se utilicen ampliamente en la detección de bacterias, especialmente en aplicaciones de campo.

En este estudio, hemos desarrollado y validado un dispositivo de microfluidos integrado con papel de filtro para atrapar células bacterianas viables inicialmente y detectarlas finalmente. Para unir el dispositivo microfluídico se empleó una unión solvente asistida térmicamente inducida por microondas, fácil, de bajo costo, rápida y respetuosa con el medio ambiente. La captura bacteriana se realiza sobre el papel de filtro y la detección se realiza in situ. Después de atrapar las células en el papel de filtro, se utiliza un ensayo basado en resazurina como se informó anteriormente, y el cambio de fluorescencia debido a las células atrapadas (si las hay) se monitorea usando el fluorómetro multicanal desarrollado previamente13. Hasta donde sabemos, en este estudio, hemos demostrado la unión inducida por microondas para desarrollar por primera vez un dispositivo de microfluidos con papeles de filtro integrados para la detección de carga biológica.

Se diseñaron y fabricaron diferentes capas de microfluidos para el alojamiento y soporte del papel de filtro dentro del dispositivo. Hemos explorado diferentes materiales y tamaños de papeles de filtro y hemos optimizado los parámetros para lograr una mayor señal de fluorescencia y una detección sensible de la carga biológica. Se probó la cepa Bacillus subtilis para validar el dispositivo. Bacillus es una bacteria grampositiva muy extendida que es dañina para los seres humanos, las plantas u otros organismos y causa enfermedades infecciosas graves32,33,34. Se prepararon diferentes muestras concentradas de bacterias y se pasaron a través del dispositivo en la misma cantidad junto con el control negativo. Nuestros resultados muestran que el casete de microfluidos integrado con filtro demostró una sensibilidad mucho mayor y un LOD más bajo que el espectrofotómetro del dispositivo de medición de fluorescencia estándar de oro y un casete de microfluidos normal en el fluorómetro multicanal. Además, el LOD se puede mejorar con un filtrado de mayor volumen. La sensibilidad mejorada por el dispositivo de microfluidos puede conducir a una mayor precisión de detección y la detección se puede realizar en 3 minutos rápidos en el fluorómetro después de 6 h de incubación de las muestras. Cada dispositivo de microfluidos cuesta alrededor de $1,6 y el fluorómetro de 8 canales cuesta aproximadamente $1300, lo que puede reducirse aún más aumentando la producción y es rentable en comparación con los instrumentos convencionales. El dispositivo de microfluidos sencillo y de fácil conexión en combinación con el fluorómetro se puede utilizar para una detección rápida, altamente sensible y precisa de la carga biológica en aplicaciones de salud, farmacéuticas y ambientales, superando las limitaciones de los dispositivos de microfluidos informados anteriormente.

Las láminas de polimetilmetacrilato (PMMA) utilizadas en este estudio se cortaron con láser y se unieron como se describe en nuestra publicación anterior31. Brevemente, se cortaron canales de microfluidos en sustratos de acuerdo con los requisitos. Se tomó etanol en una jeringa o micropipeta y se roció sobre la superficie de la lámina para cubrir toda la superficie del PMMA a unir. Luego, las láminas de PMMA que se iban a unir se presionaron a mano y luego se insertaron en un tornillo de banco de polieteretercetona (PEEK) y todo el conjunto se colocó en el microondas durante 1,5 minutos. El etanol absoluto y el calentamiento por microondas utilizados para unir el dispositivo son eficaces tanto para la esterilización del filtro como del dispositivo.

El dispositivo de microfluidos constaba de seis capas diferentes de PMMA de diferentes espesores de dimensiones 50 mm × 22 mm. La Figura 1a muestra el diagrama esquemático de diferentes capas utilizadas para la fabricación de dispositivos de microfluidos con los números de capa al lado. La capa superior de 0,2 mm tenía una abertura para la entrada y la salida. Se utilizaron cierres luer de policarbonato para inyectar y extraer las muestras. La segunda capa constaba de un canal para guiar la muestra fuera del dispositivo. La tercera y cuarta capas actuaron como soporte para el papel de filtro con aberturas o conductos para que la muestra se filtrara y pasara. La tercera capa también consta de varias estructuras diagonales que sostienen el papel de filtro y evitan la deformación durante la filtración. La quinta capa tenía un canal para guiar la muestra a través del papel de filtro y la capa inferior formaba un sello para todo el dispositivo. El diámetro del filtro era 2 mm mayor que el del orificio circular para cubrir toda la región de filtración. Además, el diámetro del papel de filtro se eligió de manera que se superponga con el canal de entrada y salida para garantizar que se filtre la totalidad de la muestra. Como el fotodetector está ubicado en la parte inferior del dispositivo, los casetes se fabricaron y unieron de tal manera que la muestra pasa por la entrada y pasa primero por la parte inferior del filtro y luego sale por la salida. De esta manera, el papel de filtro no oscurece la emisión de fluorescencia. Para la unión, cada una de las capas se humedeció con etanol y se colocó papel de filtro entre las capas como se muestra en la Fig. 1a. La Figura 1b muestra una fotografía real del casete de microfluidos con diferentes secciones del casete etiquetadas. Para detectar la carga biológica en el dispositivo de microfluidos desarrollado, el papel de filtro no necesita ninguna modificación en la superficie, lo que facilita el proceso general y no se observó deformación en el papel de filtro después de la unión.

(a) Diferentes capas del dispositivo microfluídico integrado con papel de filtro con el espesor correspondiente. (b) (Izquierda) Fotografía de un dispositivo de microfluidos adherido con diferentes secciones, (derecha) un dispositivo de microfluidos con la muestra de resazurina.

Inicialmente, en este estudio se probaron cinco papeles de filtro diferentes. Son polietersulfona (PES), poliacrilonitrilo (PAN), policarbonato gris (PC), nucleoporos grabados (NTE) y filtros de nailon. Se eligieron estos diferentes papeles de filtro debido a su amplio uso para la captura y detección de bacterias35,36,37,38,39. Se ensayó la autofluorescencia de los diferentes papeles de filtro en el fluorómetro. Los papeles de filtro se cortaron de las láminas de membrana de filtro utilizando una perforadora. Se unieron dispositivos de microfluidos utilizando la técnica inducida por microondas para todos los papeles de filtro y se observaron deformaciones y distorsiones, es decir, flexiones y grietas. Para la detección de carga biológica, la esterilidad es una preocupación importante. Como los papeles de filtro no están preesterilizados, pueden ser susceptibles a la contaminación dependiendo de las condiciones de almacenamiento. Por lo tanto, se probó la esterilidad de los papeles de filtro y se seleccionó el mejor papel de filtro en términos de esterilidad y autofluorescencia para experimentos posteriores.

Para las pruebas de esterilidad, se filtraron 10 ml de caldo de lisogenia (LB) de control negativo con diferentes filtros no estériles en una carcasa de filtro manual. Posteriormente, las células se recuperaron en 1 ml de LB fresco y se incubaron 200 µl de la muestra en la placa de agar a 37 °C durante 24 h y se contaron las colonias. Además, para determinar la eficacia de la esterilización con alcohol, se vertieron 5 ml de etanol al 70% en una placa de Petri estéril. Los filtros se sumergieron en etanol al 70% durante un minuto. Luego se colocaron los filtros en portafiltros y se lavaron dos veces con 10 ml de agua desionizada estéril. Posteriormente, se filtraron 10 ml de LB a través de filtros estériles y las células se recuperaron en 1 ml de medio LB fresco y se repitió el procedimiento anterior para contar las unidades formadoras de colonias.

Los detalles del fluorómetro multicanal se describen en la información de respaldo.

Los dispositivos de microfluidos se probaron para detectar fugas y explotaron al seleccionar el material y el diámetro del papel de filtro. Para las pruebas de explosión, la entrada del dispositivo se conectó a un flujo de aire presurizado que puede alcanzar hasta 60 psi y la salida se bloqueó. El dispositivo se colocó bajo agua y el flujo se aumentó en un psi a la vez hasta que se observaron burbujas de aire en el agua proveniente del dispositivo adherido y se observó que el papel de filtro no tenía roturas ni distorsiones. También se aplicaron las mismas configuraciones para evaluar la prueba de fuga, solo que la presión se aumentó ligeramente desde cero y se inspeccionó el casete en busca de burbujas de aire provenientes de los dispositivos de microfluidos unidos. Se obtuvo un valor estadísticamente significativo de la presión de rotura y el porcentaje de dispositivos defectuosos realizando las pruebas de fuga y de rotura diez veces cada una.

Además, se probó el perfil de acumulación de presión del dispositivo de microfluidos para garantizar que el papel de filtro y el conjunto del dispositivo de microfluidos tuvieran la fuerza de unión para manejar la presión sin deformaciones durante la inyección y filtración de la muestra. La caída de presión en el dispositivo se evaluó con un medio LB de control negativo y una solución bacteriana altamente concentrada (100 UFC/mL) después de 10 h de incubación. La presión se midió usando una bomba de jeringa y un conjunto de sensor de presión. El sensor de presión (PendoTECH PMAT) se colocó entre la entrada del dispositivo de microfluidos y una bomba de jeringa. El flujo de la bomba de jeringa se ajustó a una velocidad de 5 ml/min y se filtraron 20 ml de cada muestra. La caída de presión se calculó para ambas muestras y se comparó con la prueba de estallido para garantizar el funcionamiento adecuado del papel de filtro y del dispositivo.

La preparación de células de cultivo primario y secundario se realiza de la misma manera que nuestras publicaciones anteriores13. Brevemente, se preparó un cultivo primario de 50 ml utilizando 200 µl de células de Bacillus, que se cultivaron a 37 °C en un agitador a 150 rpm (Lab-line Instruments, Melrose Park, IL) durante la noche. Se midió que la densidad óptica del cultivo primario era 2,5 a 600 nm (SpectraMax M5). El cultivo de semilla primario (1%) se usó para inocular en 200 ml de cultivo secundario y se cultivó a 37 °C en un agitador a 150 rpm para alcanzar una densidad óptica de 0,4 a 600 nm (~ 3 × 108 UFC/ml). Esto se centrifugó a 5000 RPM (centrífuga Avanti J-25 I, Beckman Coulter, Inc., Brea, CA) durante 10 minutos. El sedimento celular se lavó con solución salina tamponada con fosfato (PBS, pH 7,2) y las células lavadas se resuspendieron en PBS, pH 7,2. Esta muestra se utiliza para realizar diluciones seriadas (en tubos de 50 ml) de 1:10 a 1:105. La muestra diluida 1:105 se utiliza para realizar diluciones adicionales para obtener una concentración final de células viables que se calibra frente a un recuento de placa estándar. Para ello se prepararon las muestras diluidas desde 1000 UFC/mL hasta 1 UFC/mL. Después de preparar diferentes muestras, se incubaron en matraces agitados a 37 °C durante 6 h, como se optimizó en nuestra publicación anterior13. Paralelamente, se esparcieron 200 µL de cada muestra en una placa de agar LB y las placas se colocaron en una incubadora a 37 °C durante la noche. Después de aproximadamente 24 h, se contó el número de colonias que aparecían en las placas. En nuestro estudio se utiliza principalmente resazurina 5 µM para el estudio de reducción. El mecanismo de uso de resazurina para la prueba de viabilidad se proporciona en la información complementaria.

Después de la incubación, las muestras se pasaron a través de la entrada del dispositivo de microfluidos. Se pasó lentamente un volumen particular (inicialmente 1 ml) de la muestra a través del dispositivo de microfluidos. Se utilizaron dos jeringas para inyectar y lavar las muestras. Como debido a la estructura había cavidades debajo y encima del papel de filtro, cualquier muestra restante de estas regiones se eliminó con las jeringas. Después de filtrar todas las muestras, se tomó resazurina 5 µM y se empujó dentro del casete con una jeringa en la cantidad justa (~ 150 µL) necesaria para llenar el lado inferior del papel de filtro donde quedan atrapadas las células. Después de inyectar la resazurina, el casete se colocó inmediatamente en un soporte de casete en el fluorómetro multicanal y se midió la fluorescencia. Paralelamente, las muestras también se analizaron en el casete de microfluidos normal (Fig. S2) en el fluorómetro6 y en placas de 96 pocillos en el espectrofotómetro. Se probaron Bacillus subtilis para comparar el LOD del dispositivo de microfluidos con filtro integrado con los casetes de microfluidos normales en el fluorómetro multicanal y las placas de 96 pocillos en el espectrofotómetro. Las muestras bacterianas se prepararon y analizaron en dos tipos diferentes de casetes de microfluidos y en el espectrofotómetro por duplicado. Cada prueba se realizó con el medio LB de control negativo. El protocolo experimental general se ilustra en la Fig. 2.

Diagrama de flujo de los protocolos experimentales realizados.

LOD se calculó como la concentración de células que puede inducir una señal equivalente a 3 veces el ruido.

La sensibilidad es la pendiente de fluorescencia promedio calculada a partir de las diferentes muestras bacterianas con control negativo LB, suponiendo que el medio LB contenga 0 UFC/mL. El ruido se define como la desviación estándar de las intersecciones para diferentes gráficos de respuesta del mismo experimento realizado, ya que la intersección es la pendiente del fluorómetro en el control negativo. La diferencia estadística entre dos muestras cualesquiera se calculó con una prueba t estadística de dos colas. Un valor p de ≤ 0,05 significa que existe una diferencia significativa entre las muestras de la prueba. Todo el análisis se calculó en 3 minutos de datos tanto para el espectrofotómetro como para el fluorómetro multicanal.

Como la autofluorescencia puede interferir significativamente con la medición de la fluorescencia, para esta aplicación se debe seleccionar el papel de filtro con la autofluorescencia más baja. La autofluorescencia de diferentes papeles de filtro se evaluó en el fluorómetro multicanal con el dispositivo de microfluidos. La Tabla 1 muestra la autofluorescencia en el fluorómetro multicanal para dispositivos de microfluidos con diferentes materiales de filtro. En la tabla se puede ver que el filtro de PC gris tiene la menor autofluorescencia y el filtro de nailon la más alta. Los otros cuatro materiales tienen una autofluorescencia bastante similar.

Aunque tenía la autofluorescencia más baja, el filtro de PC gris era susceptible a deformarse durante la unión inducida por microondas. Por lo tanto, este papel de filtro se descartó de la prueba de esterilización adicional.

Los resultados de la esterilidad de diferentes papeles de filtro se ilustran en la información complementaria. Con base en los resultados, considerando la preesterilidad, la autofluorescencia y las aplicaciones extensas, se eligió el filtro PES para el dispositivo de microfluidos.

Para que el papel de filtro cubra toda la zona de filtración y se mantenga en su lugar, el diámetro del filtro fue consistentemente 2 mm mayor que los orificios circulares de diferente diámetro como se mencionó anteriormente. Se ensayaron tres diámetros diferentes, es decir, 8,2 mm, 10,2 mm y 11,2 mm de la abertura circular. Se probó el diámetro de 8,2 mm, ya que coincide con la abertura del fotodiodo en el soporte del casete. El diámetro máximo se estableció en 11,2 mm, ya que excederlo haría que el papel de filtro tocara los bordes del casete y provocaría fugas. Se pasó el mismo volumen de solución de resorufina 0,1 µM y se registró la respuesta del fluorómetro. La Figura 3 muestra la intensidad de la fluorescencia para diferentes diámetros del fluorómetro. Según la figura, la abertura de mayor diámetro tiene una mayor intensidad de fluorescencia debido a la mayor área de emisión. Por lo tanto, se seleccionó el diámetro del filtro de 13,2 mm para experimentos posteriores.

Respuesta de fluorescencia de papeles de filtro PES con diferentes diámetros del orificio circular.

Se probaron las fugas y la presión de rotura de todo el conjunto como se mencionó anteriormente. De 10 dispositivos de microfluidos probados, solo se observó que 1 de cada 10 dispositivos fallaba. Esta es una prueba de la confiabilidad del mecanismo de unión y de los dispositivos de microfluidos unidos. La presión de rotura se calculó con y sin el conjunto de filtro. La tabla S2 de la información complementaria muestra la presión de rotura media de un total de 10 dispositivos.

Además, en la figura complementaria S3 se muestra el perfil de aumento de presión de todo el conjunto de microfluidos con medio LB y una muestra bacteriana de 1000 UFC/ml. Como puede verse, la caída de presión máxima durante la filtración de la muestra de 20 ml es ~ 6 psi, que es mucho menor que la presión de rotura promedio (29,2 psi) de todo el conjunto y el papel de filtro. Además, en todas las pruebas de estallido realizadas, no se observaron deformaciones en el papel de filtro. Por tanto, el dispositivo de microfluidos unido mediante este método es fiable y facilita la filtración de grandes volúmenes sin fugas ni deformación del papel de filtro.

Las muestras se probaron en dos casetes de microfluidos diferentes en el fluorómetro y en el espectrofotómetro de 96 pocillos para determinar el LOD como se mencionó anteriormente. La Figura 4a muestra la respuesta de diferentes muestras bacterianas con el control negativo en el dispositivo de microfluidos con filtro integrado. Las mediciones se tomaron cada 1,5 s y el recuadro muestra una parte de la respuesta de la muestra de 5 UFC/mL. Aunque todas las muestras se analizaron por duplicado, solo se presentan gráficamente los datos de una muestra. La Figura 4b muestra la respuesta de muestras bacterianas de 5 UFC/ml en el casete de microfluidos normal (C), el casete de microfluidos con filtro (CF) en el fluorómetro y placas de 24 pocillos en el espectrofotómetro.

(a) Diferentes respuestas de muestras bacterianas en el fluorómetro con el casete de microfluidos con filtro (b) Respuesta de una muestra bacteriana de 5 UFC/mL en dos casetes diferentes en el fluorómetro y el espectrofotómetro.

La Figura 4a muestra que al aumentar la carga bacteriana, se observa una pendiente mayor que en el medio LB que muestra muy poca o ninguna pendiente. La Figura S4 muestra la región de detección después de la filtración de LB y una muestra bacteriana y la inyección de resazurina. Para la muestra bacteriana, el tinte azul resazurina se convierte en resorufina rosa como se desprende de la figura. Para 20 y 100 UFC/mL, se observa una pendiente decreciente después de un tiempo que se debe a la reducción de la resorufina a dihidroresorufina incolora40. La descomposición ocurre más rápido y en un tiempo menor para concentraciones más altas. Según la Fig. 4b, la pendiente de fluorescencia es significativamente mayor para las muestras en casetes CF que para los casetes C y el espectrofotómetro. Los valores de pendiente son respectivamente 3,28, 0,57 y 0,33 au/s en CF, C en el fluorómetro y el espectrofotómetro, lo que muestra un aumento significativo en la sensibilidad con los casetes integrados con el filtro. Los valores de pendiente promedio se utilizaron para calcular el LOD en diferentes casetes en el fluorómetro y el espectrofotómetro.

La Figura 5a muestra la comparación de la pendiente de fluorescencia de dos casetes de microfluidos diferentes en el fluorómetro y el espectrofotómetro para diferentes muestras bacterianas concentradas. La Figura 5b muestra el LOD y la comparación de sensibilidad de estas muestras. El análisis de los datos junto con la pendiente de fluorescencia para el cálculo de la sensibilidad y el LOD se muestran en la Tabla 2. Las primeras cuatro filas representan los valores de la pendiente para diferentes concentraciones bacterianas junto con el control negativo.

( a ) Diferentes pendientes de fluorescencia de muestras bacterianas de CF, C en el fluorómetro y placas de 96 pocillos en el espectrofotómetro. (b) LOD calculado y sensibilidad de CF, C en el fluorómetro y placas de 96 pocillos en el espectrofotómetro.

Según la Fig. 5a, los valores de pendiente de los medios LB para todas las muestras son significativamente más pequeños que los de otras muestras bacterianas concentradas. Esto también se muestra en los valores p de la prueba t estadística en la Tabla 2. Además, para concentraciones bacterianas crecientes, los valores de pendiente son más altos para todas las muestras, excepto para la muestra de 100 UFC/mL en CF, que se debe a la conversión de dihidroresorufina. . Sin embargo, los valores de pendiente para las muestras en CF son significativamente más altos que los de las otras dos muestras en todos los casos. Por lo tanto, los casetes de microfluidos CF son significativamente más sensibles que los casetes de microfluidos normales y el espectrofotómetro. La Figura 5b ilustra los resultados de la sensibilidad y LOD para todas las muestras calculadas para la región lineal. Según los resultados, los casetes con filtro integrado (CF) en el fluorómetro son mucho más sensibles que los otros dos tipos de muestras, lo que da como resultado un LOD mucho más bajo. El LOD mejora ~ 3,5 veces más que el espectrofotómetro y 10 veces más que la C en el fluorómetro. El valor p de la prueba t entre los valores de sensibilidad de CF y C es 0,0097 y CF y espectrofotómetro es 0,000079, lo que muestra que la sensibilidad es estadísticamente significativamente mayor para CF. En consecuencia, las muestras en CF son alrededor de 14 y 19 veces más sensibles que las de C en el fluorómetro y el espectrofotómetro, respectivamente. Los valores exactos se muestran en la Tabla 2. La sensibilidad se calculó utilizando el rango lineal (primeros 3 minutos) de respuestas utilizando datos de 0 a 20 UFC/ml, ya que 100 UFC/ml exhibieron una respuesta no lineal.

Se pasó un volumen diferente de la misma muestra bacteriana concentrada (5 UFC/ml) a través del casete para comparar el LOD con volúmenes variables de 1, 3 y 5 ml. La respuesta de muestra para diferentes volúmenes filtrados se muestra en la Fig. 6a. La comparación de sensibilidad para diferentes volúmenes se muestra en la Fig. 6b.

(a) Respuesta del fluorómetro con los casetes de microfluidos con filtro para variar el volumen filtrado de 5 UFC/ml de Bacillus (b) Sensibilidad del dispositivo de microfluidos al aumentar el volumen de filtrado junto con el control negativo LB.

En la figura, se observa que al aumentar el volumen filtrado a través del dispositivo de microfluidos, la intensidad y la pendiente de la fluorescencia aumentan significativamente. El aumento, a su vez, mejora la sensibilidad del dispositivo de microfluidos con el fluorómetro como se muestra en la Fig. 6b. Cuanto mayor era el volumen filtrado, más células quedaban atrapadas en el papel de filtro. Esto provocó que la resazurina se redujera a resorufina más rápidamente. Para volúmenes mayores filtrados, en este caso, de 5 ml, se reduce la sensibilidad o pendiente promedio de fluorescencia. Esto ocurre como resultado de la disminución de la pendiente después de un tiempo, lo que se debe a la reducción de la resorufina a dihidroresorufina incolora, como se desprende de la Fig. 6a. En la Figura S5 se muestra un cambio similar de respuesta y aumento de la sensibilidad al aumentar el volumen a 20 UFC/mL. Sin embargo, la intensidad y la sensibilidad de la fluorescencia son significativamente mayores que las del medio LB de control negativo, lo que confirma la presencia de carga biológica. Es posible filtrar más volúmenes mediante este dispositivo de microfluidos para detectar concentraciones de carga biológica muy bajas cuando corresponda.

Nuestro dispositivo y método pueden detectar bacterias dentro de las 6 h posteriores a la incubación con muestras cultivadas en laboratorio, lo que reduce el tiempo de detección al menos cuatro veces más que el método de cultivo estándar de oro. Los métodos comparativamente rápidos como PCR, ELISA y otros métodos de biodetección tienen la desventaja de una baja sensibilidad, una detección de falsos positivos, un procedimiento técnico complicado y un alto costo. Después de la incubación, la inyección de la muestra tarda sólo un minuto dependiendo del volumen y se puede realizar fácilmente. Mientras que otros procedimientos de detección de bacterias, es decir, PCR, ELISA y métodos de cultivo bacteriano, requieren ciertos procedimientos, preparación técnica y áreas operativas extremadamente limpias que son más complicadas y requieren personal capacitado para completarlas. Aquí es donde nuestro dispositivo de microfluidos con fluorómetro supera a otros métodos convencionales para detectar cargas biológicas de nivel ultra bajo. El ensayo optimizado se puede utilizar con este dispositivo para detectar también otras cepas con mayor sensibilidad.

Existe una necesidad inherente de una detección rápida y sensible de la carga biológica en una variedad de aplicaciones, incluida la salud pública. Para detectar la carga biológica con mayor sensibilidad y precisión, en este estudio se fabricó y unió un novedoso dispositivo de microfluidos de una manera sencilla y respetuosa con el medio ambiente. Los parámetros del casete de microfluidos se han optimizado junto con el fluorómetro multicanal para una detección ultrasensible. El dispositivo de microfluidos ha demostrado ser eficaz para detectar la carga biológica con una sensibilidad mucho mayor que la de un dispositivo de microfluidos normal informado anteriormente y el espectrofotómetro. Nuestros estudios futuros incluirán probar el dispositivo de microfluidos con otras cepas bacterianas, ensayos del mundo real, eficiencia de filtración del papel de filtro e implementación de diferentes materiales biodegradables para la fabricación y la unión. El dispositivo de microfluidos puede tener un impacto de gran alcance en la detección de la carga biológica, especialmente en un entorno de punto de atención.

Todos los datos generados o analizados durante este estudio se incluyen en este artículo publicado y sus archivos de información complementarios.

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Este trabajo fue apoyado por la Administración de Drogas y Alimentos de EE. UU. bajo el contrato no. BAA75F40119C10132.

Centro de Tecnología de Sensores Avanzado, Universidad de Maryland Condado de Baltimore, Baltimore, MD, 21227, EE. UU.

Dr. Sadique Hasan, Chad Sundberg, Michael Tolosa, Xudong Ge, Yordan Kostov y Govind Rao

Departamento de Ciencias de la Computación e Ingeniería Eléctrica, Universidad de Maryland Condado de Baltimore, Baltimore, MD, 2127, EE. UU.

Dr. Sadique Hasan

Departamento de Ingeniería Química, Bioquímica y Ambiental, Universidad de Maryland Condado de Baltimore, Baltimore, MD, 2127, EE. UU.

Chad Sundberg, Xudong Ge y Govind Rao

Champions Oncology Inc, 855 N Wolfe St, Baltimore, MD, 21205, EE. UU.

Abhay Andara

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MSH, CS y MT realizaron los experimentos. YK y GR concibieron el proyecto. XG planificó los experimentos y analizó los datos. MSH escribió el manuscrito. XG, AA, YK y GR supervisaron la investigación. Todos los autores revisaron el manuscrito.

Correspondencia a Govind Rao.

GR e YK figuran como inventores en la patente estadounidense 10.948.414 B2 “Métodos y aparatos para la detección rápida de la contaminación bacteriana”.

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Reimpresiones y permisos

Hasan, M., Sundberg, C., Tolosa, M. et al. Un dispositivo de microfluidos novedoso y de bajo costo con un filtro integrado para una detección de carga biológica rápida, ultrasensible y de alto rendimiento. Representante científico 13, 12084 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-38770-x

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Recibido: 02 de mayo de 2023

Aceptado: 14 de julio de 2023

Publicado: 26 de julio de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-38770-x

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