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Mar 04, 2024

Una impresora de vacunas con microagujas para COVID termoestable

Nature Biotechnology (2023)Cite este artículo La fabricación descentralizada de vacunas de ARNm termoestables en formato de parche de microagujas (MNP) podría mejorar el acceso a las vacunas en comunidades de bajos recursos al

Nature Biotechnology (2023)Citar este artículo

La fabricación descentralizada de vacunas termoestables de ARNm en formato de parche de microagujas (MNP) podría mejorar el acceso a las vacunas en comunidades de bajos recursos al eliminar la necesidad de una cadena de frío y personal sanitario capacitado. Aquí describimos un proceso automatizado para imprimir vacunas de ARNm de la enfermedad del coronavirus MNP 2019 (COVID-19) en un dispositivo independiente. La tinta de la vacuna está compuesta de nanopartículas lipídicas cargadas con ARNm y una mezcla de polímeros solubles que se optimizó para una alta bioactividad mediante la detección de formulaciones in vitro. Demostramos que las MNP resultantes son estables durante al menos 6 meses a temperatura ambiente cuando se evalúan utilizando una construcción modelo de ARNm. La eficiencia de carga de la vacuna y la disolución de las microagujas sugieren que se podrían administrar dosis eficaces a escala de microgramos de ARNm encapsulado en nanopartículas lipídicas con un solo parche. Las inmunizaciones en ratones que utilizan MNP producidas manualmente con ARNm que codifica el dominio de unión al receptor de la proteína de pico del coronavirus 2 (SARS-CoV-2) del síndrome respiratorio agudo grave estimulan respuestas inmunitarias a largo plazo similares a las de la administración intramuscular.

Las comunidades no vacunadas en países de ingresos bajos y medianos corren un alto riesgo de sufrir brotes repetidos de la enfermedad del coronavirus 2019 (COVID-19) y otras enfermedades infecciosas1, que aumentan la mortalidad, promueven la aparición de variantes más peligrosas e impactan negativamente en la economía2. La vacunación masiva en estas comunidades se ha visto obstaculizada por problemas como una infraestructura de transporte y almacenamiento compatible con la cadena de frío y una cantidad insuficiente de personal sanitario3,4. Los sistemas locales distribuidos para fabricar vacunas adecuadas ofrecen una posible solución. Un formato de vacuna prometedor en estas regiones son los parches de microagujas termoestables (MNP)5,6,7,8. Las MNP pueden aplicarse uno mismo, son menos dolorosas que la inyección intramuscular (IM), no producen desechos punzantes, pueden formularse para permanecer estables durante meses y se han utilizado con varios tipos de vacunas, incluidos varios ácidos nucleicos9,10,11. 12,13,14. En el contexto de la COVID-19, las vacunas de ARNm encapsuladas en nanopartículas lipídicas (LNP), como las producidas por Moderna y Pfizer-BioNTech, han demostrado ser muy eficaces para prevenir enfermedades graves. Hasta donde sabemos, no se ha informado anteriormente sobre la administración intradérmica (ID) de una vacuna de ARNm en un vehículo LNP utilizando un MNP con termoestabilidad a largo plazo.

La fabricación de MNP introduce nuevos desafíos en fabricación, carga y escalabilidad que han ralentizado su desarrollo, a pesar de ser ideales para su implementación en áreas de bajos recursos15,16,17,18. Para una dosificación precisa y una penetración adecuada en la piel, las microagujas deben ser afiladas y de tamaño constante de un lote a otro19. Las MNP están limitadas por el pequeño volumen disponible para la carga de vacunas, especialmente cuando se requieren excipientes para estabilizar antígenos lábiles20. Los MNP suelen estar hechos a mano individualmente con pasos manuales, imprecisos y que requieren mucha mano de obra, como la centrifugación, lo que dificulta la fabricación consistente y automatizada utilizando estos métodos21.

Aquí describimos una impresora de vacunas con microagujas (MVP) para fabricar MNP solubles cargadas con vacunas de ARNm encapsuladas en LNP u otras cargas (Fig. 1a-c). La integración de un proceso de fabricación de microagujas dentro de un dispositivo modular independiente presenta desafíos únicos. La formación de microagujas, que normalmente se logra mediante moldeo22, fabricación de gotas23, impresión por inyección de tinta24,25 o impresión 3D26,27,28, debe producir microagujas con características nítidas, precisas y de escala micrométrica. El llenado del molde debe ser impulsado por un proceso repetible que minimice el desperdicio, reduzca las piezas móviles, no requiera interacción del usuario y se integre en un flujo de trabajo automatizado impulsado por una máquina. En cada ejecución, el MVP dispensa tinta para vacunas, llena moldes de microagujas sin alterar la tinta mediante vacío para eliminar el aire a través del molde y acelera el secado mediante un flujo de trabajo automatizado con mínima intervención humana. El flujo de trabajo automatizado integra un dispensador robótico de alta precisión, una cámara de vacío programable y etapas de movimiento modulares que contienen moldes de microagujas reutilizables. El proceso utilizado en el dispositivo se basa en la aplicación de vacío, es compatible con una amplia gama de diseños de MNP y está optimizado para minimizar el desperdicio de vacunas.

a. Las tintas modulares que contienen ARNm, lípidos y polímeros se pueden personalizar para la impresión de vacunas con microagujas. b,c, El MVP (b) se puede distribuir a áreas remotas para proporcionar capacidad de fabricación local (c) de MNP termoestables. d, Después de la dispensación automatizada, se aplica vacío a través de PDMS para cargar la solución de vacuna de polímero en el molde de microagujas. Luego los moldes se transfieren a una estación de secado para un secado acelerado. e, Se midió el tiempo necesario para cargar la solución de vacuna de polímero en el molde PDMS para varios parámetros de diseño y proceso. Se utilizaron pruebas t de dos colas no apareadas para todas las comparaciones, excepto para el tipo de polímero, donde se utilizó un ANOVA unidireccional ordinario (n = 3 muestras independientes). f, Tasa de secado para diferentes estrategias de secado. Se utilizó ANCOVA para comparar las estimaciones de la velocidad de secado, que se derivaron de una regresión lineal de los datos de la velocidad de secado (n = 3 muestras independientes). g, el área de caída total (n = 3 muestras independientes) y la cobertura del parche (n = 100 muestras independientes) son función de la solución de polímero utilizada para la dispensación. h, Imágenes de MNP fabricadas con el dispositivo: MNP sobre soporte sólido acrílico (arriba a la izquierda), imagen SEM de MNP con geometrías cónica (arriba a la derecha) y piramidal (abajo a la izquierda) y una MNP de pirámide única (abajo a la derecha). i, Imágenes de MNP cargadas con punta (delineadas en blanco) dispensadas conjuntamente con el dispositivo usando tinte rojo (arriba) o azul (abajo) como carga modelo. j, rendimiento de producción de MNP. k, rendimiento de MNP en función del tiempo de secado y la longitud de la bandeja de impresión. Los datos representan la media ± sd (e,g) o la media ± intervalo de confianza del 95% (f). Los valores de P están representados por: *P ≤ 0,05; **P ≤ 0,01; ***P ≤ 0,001; ****P ≤ 0,0001. NS, no significativo.

La impresión con microagujas requiere la incorporación de un polímero soluble estabilizador en una tinta de ARNm-LNP consistentemente dispensable. Después de examinar exhaustivamente las tintas in vitro, determinamos que una combinación de polímeros solubles podría administrar con éxito ARNm activo encapsulado en LNP y mantener la estabilidad durante al menos 6 meses a temperatura ambiente. Utilizando ARNm que codifica el dominio de unión al receptor (RBD) de la proteína de pico (S) del SARS-CoV-2, mostramos que las MNP producidas por el MVP tienen propiedades mecánicas adecuadas y penetran con éxito en la epidermis porcina tras su aplicación ex vivo. Las pruebas in vivo de MNP producidas manualmente demostraron una respuesta inmune similar a la de la administración IM.

Desarrollamos una técnica basada en vacío para introducir tintas de vacunas viscosas en moldes. El proceso se basa en la permeabilidad del aire y la solubilidad en polidimetilsiloxano (PDMS)29. Al aplicar vacío directamente al fondo del molde PDMS durante el llenado (Fig. 1d y Datos ampliados, Fig. 1a) o desgasificando previamente el molde PDMS inmediatamente antes del llenado (Datos ampliados, Fig. 1b), se pueden obtener soluciones viscosas de polímero y vacuna. podría cargarse en moldes (vídeos complementarios 1 y 2).

Para ambos enfoques se estudió el efecto de varios parámetros de proceso y diseño sobre el tiempo de carga y la formación de MNP (Datos ampliados, figuras 1c-j). Cuando se aplica vacío directamente al molde, el tiempo de carga depende del espesor y la composición de la lámina de PDMS, el patrón utilizado para aplicar vacío debajo del molde de PDMS y el gradiente de presión aplicado (Fig. 1e). La carga de tintas cada vez más viscosas (Datos ampliados, figura 1k) requirió menos de 20 minutos. Aunque la aplicación de vacío durante la fabricación de microagujas es común, el vacío generalmente se aplica a la atmósfera sobre el molde, lo que da como resultado la formación de burbujas en la vacuna y la solución de polímero30,31. La aplicación de vacío directamente al molde PDMS evita la formación de burbujas y elimina la necesidad de centrifugación, lo que proporciona un proceso repetible que permite la automatización y se puede ampliar o reducir para cumplir con cualquier tamaño o cantidad de MNP.

Para reducir el desperdicio de vacunas y el tiempo de secado, dispensamos el volumen mínimo posible de tinta de vacuna necesario para llenar las microagujas. Ajustamos la concentración de polímero para producir una película delgada y homogénea de polímero seco con resistencia mecánica suficiente para sobrevivir al desmolde (Datos ampliados, Fig. 2a). La dispensación se caracterizó por el área de gota de tinta dispensada y la circularidad del soporte formado después del secado. Al aumentar la viscosidad para minimizar el efecto Marangoni, que lleva el polímero y la vacuna a los bordes de la gota de secado, maximizamos la circularidad y la cobertura del molde, medidas en agujas llenas por molde (Datos ampliados, Fig. 2b, c). Utilizando el análisis termogravimétrico para evaluar el tiempo de secado, determinamos que la aplicación simultánea de vacío debajo y una atmósfera de vacío desecada arriba, los moldes MNP aceleraron el secado del parche sin formación de burbujas (Fig. 1f y Nota complementaria 1).

Para minimizar la interacción del usuario y la necesidad de capacitación en el sitio, los procesos anteriores se automatizaron utilizando componentes programables. Se fabricó una etapa de traducción x-y personalizada con vacío debajo (carga) y arriba (secado), con capacidad para hasta 100 moldes MNP a la vez (video complementario 3 y datos ampliados, figuras 3a-e). Los procesos de carga y secado al vacío se combinaron con un brazo robótico para una dispensación repetible y programable con precisión a escala de microlitros (vídeos complementarios 4 y 5 y datos ampliados, figura 3f). Se optimizaron parámetros como el patrón de dispensación, el volumen dispensado y la altura de dispensación para minimizar el desperdicio de vacunas y producir MNP con un respaldo ultrafino (Datos ampliados, figuras 3g-k). Con un conjunto de parámetros de dispensación, se dispensaron tres sistemas de polímeros solubles diferentes con una cobertura del molde superior al 80% (Fig. 1g). El MVP permitió la fabricación automatizada de varios diseños de microagujas, incluidas matrices de 10 × 10 (Datos ampliados, figura 3l) de microagujas piramidales y cónicas de hasta 1500 µm de altura fabricadas a partir de una selección de polímeros solubles comunes para la administración de vacunas utilizando MNP (Figura 1h). ).

La vacuna que se seca en el respaldo del MNP genera desperdicios adicionales de vacuna. Para reducir el desperdicio, implementamos un proceso de carga de puntas de dos pasos que se había utilizado anteriormente para concentrar la vacuna en puntas de microagujas8,32. Primero, se carga en el molde una tinta de vacuna que contiene la cantidad mínima de polímero necesaria para estabilizar la vacuna y se seca. Luego, se dispensa una tinta de polímero únicamente y se seca para formar el soporte (Datos ampliados, Fig. 4a,b). El MVP también se puede utilizar para cargar varias cargas simultáneamente, como lo demuestra la carga de tinte rojo y azul en diferentes MNP (Fig. 1i). Los MNP cargados con punta impresos con el MVP tienen microagujas afiladas y 100% correctamente formadas (Datos ampliados, figura 4c).

Se desarrolló un modelo matemático para cuantificar la cantidad de parches que se pueden fabricar por día en función de diferentes parámetros de diseño (Notas complementarias 2 y 3 y datos ampliados, figuras 4d a g). El rendimiento del MVP está limitado por el paso más lento del proceso, que puede ser el paso de dispensación o el paso de secado según el tamaño del dispositivo, lo que demuestra la importancia de comprender ambos (Fig. 1j). El procesamiento continuo es posible cuando los procesos de los componentes están siempre en ejecución y los rendimientos de dispensación y secado son iguales. Se trazaron varios contornos de diseño para capturar el rendimiento de cualquier dispositivo considerando parámetros como el tiempo de secado y la dimensión de la bandeja de carga (Fig. 1k) o el tamaño del parche (Datos extendidos, Fig. 4d).

Aunque una impresora de primera generación es capaz de fabricar 100 parches en 48 h, esto se puede aumentar cambiando el tamaño y la complejidad de la etapa de dispensación y el área de secado. El modelo puede ser una herramienta integradora para informar las consideraciones de diseño hacia un aumento del rendimiento. Esto se puede lograr de manera eficiente apilando moldes de bandejas de microagujas modulares verticalmente dentro del MVP (Datos extendidos Fig. 5a, b) o fabricando MNP continuamente usando una etapa de pretratamiento para desgasificar las bandejas de moldes de microagujas antes de su dispensación (Datos extendidos Fig. 5c ). La extracción y el empaquetado de parches también podrían automatizarse en diseños futuros utilizando un brazo robótico (Datos ampliados, figuras 5d a g).

Luego, el MVP se utilizó para cargar varios productos biológicos, específicamente LNP cargados con proteínas, ADN y ARNm. La carga de puntas de dos pasos con BSA aumenta notablemente la eficiencia de carga, definida como el porcentaje de carga utilizada para la fabricación que se mide en las puntas de microagujas, en comparación con la fabricación de MNP en un solo paso (Fig. 2a). Luego se optimizó la masa de tinta de vacuna que se utiliza durante el primer paso del proceso de dos pasos para producir una alta eficiencia de carga (Datos ampliados, Fig. 6a, b). Observamos que la eficiencia de carga aumenta al disminuir la masa de la formulación (Datos ampliados, figura 6c). Usando el mejor procedimiento de carga, se cargaron con punta y se dispensaron 32 µg de ADN y 90 µg de BSA simultáneamente usando el MVP, con una eficiencia de carga similar (Fig. 2b). La carga lograda con el MVP coincidió con la que se obtiene cuando las MNP se fabrican manualmente mediante técnicas de laboratorio estándar, lo que confirma aún más la automatización exitosa del proceso de fabricación para varios antígenos y vectores (Fig. 2b). La altura de dispensación se redujo para reducir la variación de carga (Datos ampliados, figura 6d). La carga de una vacuna de ADN es consistente (sd = 1,6 µg) en la superficie de una bandeja con 100 moldes MNP sin tendencias detectables en función de la posición (Fig. 2c y Datos ampliados Fig. 6e).

a, Eficiencia de carga de microagujas de uno y dos pasos (n = 6 muestras independientes). b, la eficiencia de carga de ADN y proteínas en las MNP fabricadas manualmente es similar a las realizadas con el MVP (n = 4–9 muestras independientes). c, Mapa de calor que muestra la carga constante de ADN en MNP en una bandeja de 10 × 10 de moldes de MNP. Cada cuadrado es un parche individual. Las flechas negras indican el movimiento del dispensador de vacunas. d, las MNP consisten en un polímero estabilizador y LNP, que tienen cuatro componentes lipídicos. e, f, los LNP que encapsulan el ARNm que codifica fLuc se mezclaron con varios polímeros solubles en agua y se secaron. La expresión de proteínas en células HeLa se midió después de la transfección con polímero redisuelto para detectar una combinación de polímeros que produzca una expresión de proteínas similar a las LNP en suspensión (n = 4 réplicas técnicas). g, las microagujas se disuelven y administran vacunas de ARNm-LNP al espacio intradérmico. h, Luminiscencia 6 h después de la aplicación de MNP en la almohadilla plantar en ratones para LNP elaborados con lípido 5 o cKK-E12 (n = 5 muestras biológicamente independientes). i, Comparación de la administración IM, MNP fabricada manualmente y MNP impresa de LNP de lípido 5 que contienen 1 µg de ARNm de fLuc (n = 5 muestras biológicamente independientes). Los datos representan la media ± sd (a,b,e,f) o la media ± sem (h,i). Se utilizaron pruebas t no apareadas de dos colas (a, b), ANOVA ordinario de dos factores (h) o ANOVA ordinario de un factor (i) (prueba de comparaciones múltiples de Sidak). Los valores de P están representados por: *P ≤ 0,05; **P ≤ 0,01; ***P ≤ 0,001; ****P ≤ 0,0001. promedio, promedio; dev., desviación; NS, no significativo.

A continuación, probamos la impresión de MNP que incorporan ARNm-LNP estabilizados en una matriz polimérica soluble. Las LNP son especialmente difíciles de secar en una matriz sólida porque se debe preservar tanto la estabilidad química como la coloidal33. Además, el volumen de polímero disponible en las microagujas es limitado, lo que dificulta prevenir la agregación de LNP. Para investigar los polímeros solubles para estabilizar los LNP, comparamos varios polímeros biocompatibles que se usan comúnmente para fabricar microagujas solubles en función de su capacidad para mantener la estabilidad de los LNP en proporciones de masa de polímero a ARNm decrecientes. Se fabricaron LNP de aproximadamente 147 nm de diámetro y potencial de superficie de −2,7 ± 0,6 mV que encapsulan el ARNm que codifica la luciferasa de luciérnaga (fLuc) utilizando lípidos ionizables, fosfolípidos, colesterol y lípidos pegilados (Fig. 2d y datos ampliados, Fig. 7a-c) 34.

Luego se mezclaron los LNP con varios polímeros solubles y se secaron. Después de la redisolución de la matriz seca, se usaron LNP para transfectar células HeLa, y se midieron tanto la viabilidad celular como la expresión de fLuc en relación con las LNP frescas y sin secar. Ninguna de las formulaciones probó una viabilidad celular deteriorada en comparación con las LNP solas (Datos ampliados, figura 7d). Las formulaciones que contienen más del 50% de alcohol polivinílico (PVA) de la masa total son mejores para estabilizar las LNP (Fig. 2e), mientras que otros materiales de MNP solubles comunes funcionan mal (Fig. 2f). La lenta velocidad de secado del PVA (Datos ampliados, Fig. 7e), la higroscopicidad y la viscosidad (Datos ampliados, Fig. 1k) se pueden superar mezclándolo con polivinilpirrolidona (PVP, un polímero de secado más rápido con propiedades mecánicas deseables (Datos ampliados, Fig. 7f,g). ) -sin sacrificar la estabilidad. Los LNP están intactos después de la disolución de la matriz polimérica de MNP, mostrando un aumento moderado en el diámetro (Datos extendidos Fig. 7h), estructura típica en microscopía electrónica de transmisión (TEM) (Datos extendidos Fig. 7i-k) y conservados. Tamaño del ARNm (Datos ampliados, figura 7l).

Intentamos seleccionar una formulación de LNP adecuada para la administración ID a través de MNP (Fig. 2g) a partir de dos lípidos ionizables principales diferentes con estructuras y pKa muy diferentes: cKK-e12 y Lípido 5 (refs. 34, 35, 36). Se informó ampliamente que cKK-e12 era eficiente en la administración de oligonucleótidos mediante administración intravenosa (IV), mientras que el lípido 5 se seleccionó de una familia de lípidos estudiados para administración IM e IV. Se caracterizaron los LNP de cada tipo que encapsulan el ARNm de fLuc (Datos ampliados, figuras 7a a c) y se cargaron en las microagujas de los MNP utilizando la mejor formulación de polímero soluble estabilizador y el método de carga más eficiente, es decir, relación de masa PVP:PVA 1:1 y Fabricación en dos pasos. Se midió la carga de ARNm encapsulado en cada una de las 100 microagujas de una MNP. Descubrimos que, aunque la distribución del ARNm dentro de la MNP es heterogénea, la variación entre lotes es baja, con aproximadamente 1,0 µg de punta de ARNm cargada por MNP (Datos ampliados, figuras 7m-p). La expresión de proteínas después de la transfección de HeLa con LNP o LNP redisueltas del parche de microagujas mostró que el proceso de fabricación de MNP no afecta la actividad de LNP in vitro (Datos ampliados, figura 7q). Se aplicaron MNP a la almohadilla plantar de ratones y se midió la expresión de fLuc mediante luminiscencia37. Los LNP con lípido 5 tienen una expresión de proteínas mucho mayor en respuesta a la dosis que cKK-e12 (Fig. 2h), lo que parece prometedor para un uso posterior en la administración de ID.

Para investigar la administración ID de una vacuna de ARNm basada en LNP utilizando MNP, medimos nuevamente la expresión de proteínas in vivo usando ARNm de fLuc encapsulado en LNP, esta vez comparando la aplicación ID de MNP en la almohadilla plantar con la administración IM de una cantidad equivalente de ARNm de fLuc en LNP (Fig. .2i). La expresión de proteínas a las 24 h es significativamente mayor cuando las LNP se administran mediante MNP en lugar de inyección IM. También comparamos la expresión de proteínas cuando las MNP se fabricaron manualmente versus las impresas con el MVP. El proceso de impresión automatizado no afecta la actividad de LNP in vivo (Fig. 2i).

Evaluamos las propiedades mecánicas y funcionales de las MNP producidas con la combinación de polímeros más capaces de estabilizar las LNP. Tanto las agujas cónicas como las piramidales se consideraron geometrías potencialmente viables que ofrecen diferentes volúmenes entregables y ángulos de punta (Datos ampliados, figura 8a y tabla complementaria 1), que se ha demostrado que influyen en la penetración y disolución de la piel38. En términos de fuerza máxima (Fig. 3a) y rigidez (Fig. 3b), las MNP piramidales hechas de PVP:PVA superan a las MNP cónicas de la misma composición, y todas las MNP cumplen con los requisitos mínimos para perforar la piel39. Para ambas geometrías, la punción de piel de cerdo ex vivo (Fig. 3c) se evaluó mediante histología y la disolución de microagujas se evaluó mediante análisis de imágenes de microscopía óptica (Fig. 3d, ey Datos ampliados Fig. 8b). Aunque ambas geometrías pueden acceder a la dermis, el 36 % del volumen de la microaguja piramidal se disolvió en 10 minutos en comparación con solo el 8 % del volumen de la microaguja cónica, lo que permitió una mayor administración de la vacuna, posiblemente debido a su ángulo de punta más pequeño y más agudo40. Por lo tanto, se utilizaron MNP piramidales para todos los experimentos siguientes. Se puede aumentar la fracción de PVP (datos extendidos, figuras 8c-e) y LNP (datos extendidos, figura 8f) en la mezcla para aumentar el volumen disuelto.

a,b, Las MNP piramidales hechas de PVP:PVA son más rígidas (a) y más fuertes (b) que las MNP cónicas de tamaño similar (n = 10 muestras independientes). Pruebas t de dos colas no apareadas. c, Tanto las MNP cónicas como las piramidales son capaces de penetrar (flechas negras) la epidermis (e) y acceder a la dermis (d) para la administración de ID. d, e, las MNP piramidales se disuelven significativamente más rápido que las MNP cónicas utilizando imágenes ópticas e antes y después de la aplicación (n = 3 muestras independientes). Pruebas t de dos colas no apareadas. f, los GMT son similares entre IM y MNP para el ARNm de RBD del SARS-CoV-2 (n = 5 muestras biológicamente independientes). ANOVA ordinario de dos factores (prueba de comparaciones múltiples de Sidak). g, Títulos de IgG de proteína anti-RBD hasta la semana 11, que muestran las diferentes cinéticas de las respuestas humorales entre la administración de MNP e IM y respuestas similares para el ARNm de RBD del SARS-CoV-2 (n = 5 muestras biológicamente independientes). h, Respuestas del ensayo de unión anti-RBD en suero por electroquimioluminiscencia para variantes del SARS-CoV-2 que muestran respuestas similares para IM y MNP con ARNm de RBD del SARS-CoV-2 (n = 5 muestras biológicamente independientes). ANOVA ordinario de dos factores (prueba de comparaciones múltiples de Sidak). i, PVP: PVA estabiliza los ARNm-LNP en MNP para una alta expresión de proteínas después de 6 meses de almacenamiento a temperatura ambiente (n = 5 muestras biológicamente independientes). Cada conjunto de datos se traza con un ajuste lineal y el intervalo de confianza del 95 % está sombreado. j, Relación de diseño para cumplir con los requisitos de dosificación en humanos para vacunas de ARNm comunes, que ilustra la relación entre el volumen de una sola microaguja, las microagujas por MNP y la dosis administrada en una sola MNP. Las flechas negras indican el tamaño (en microagujas por MNP) donde se satisface una dosis humana de ARNm para el volumen constante de microagujas utilizado en estos estudios. Los datos representan la media ± sd (a, b, d) o la media ± sem (f – i). Los valores de P están representados por: *P ≤ 0,05; **P ≤ 0,01; ***P ≤ 0,001; ****P ≤ 0,0001. MPa, megapascales; N, Newton; NS, no significativo.

Para desarrollar una vacuna contra el SARS-CoV-2 para su administración por MNP, utilizamos un ARNm que codifica el RBD, modificado con un motivo de trimerización T4, similar a la construcción de la vacuna BNT162b1 (Datos ampliados, figura 9a)41. Antes de la carga en dos pasos, las LNP que contenían ARNm de SARS-CoV-2 se dializaron en agua y se concentraron mediante filtración centrífuga para aumentar la capacidad de carga de MNP (Datos ampliados, Fig. 9b, c)42. Para los LNP, la eficiencia de carga también aumentó al hacer MNP más pequeños, lo que limita el efecto Marangoni al área cubierta por microagujas en lugar del perímetro del parche (Datos ampliados, Fig. 9d, e). De lo contrario, las MNP se fabricaron de acuerdo con la carga de dos pasos descrita en las Figs. 1 y 2, utilizando PVP:PVA 1:1 en una proporción de masa de 0,32 (mg µg –1) para estabilizar las LNP y el lípido ionizable Lípido 5 para maximizar la expresión de proteínas intradérmicas. Utilizamos células HEK para confirmar la expresión de los vectores basados ​​en ARNm del SARS-CoV-2 (Datos ampliados, figura 9f).

Basándonos en informes anteriores, utilizamos un modelo de ratón para evaluar la inmunogenicidad de la vacuna contra el SARS-CoV-243. Las vacunas se administraron en una dosis de 6 μg de ARNm encapsulado (Datos ampliados, figura 9g-i) a través de MNP en la almohadilla plantar de ratones C57BL/6, y se administró un refuerzo de MNP 28 días después (Datos ampliados, figura 10a). Como control, se administró una suspensión de ARNm-LNP a una dosis de ARNm de 10 μg mediante inyección IM en la extremidad trasera siguiendo el mismo programa. Se recogió suero cada 2 semanas y se analizó la unión de títulos de IgG anti-RBD. 3 semanas después del refuerzo, medimos títulos medios geométricos (GMT) similares entre IM y MNP para la vacuna de ARNm de RBD (Fig. 3f). Las respuestas posteriores al refuerzo son inferiores a las informadas para las vacunas mRNA-LNP del SARS-CoV-2 autorizadas en un modelo C57BL/6, que utiliza diferentes ARNm y lípidos, pero las respuestas posteriores al refuerzo son similares43,44.

Aunque todos los ratones que reciben ARNm-LNP finalmente producen GMT altos, aquellos que los reciben IM responden dentro de 1 semana al refuerzo, mientras que aquellos que los reciben a través de MNP responden dentro de 3 semanas al refuerzo (ARNm de RBD; Fig. 3g). También observamos que la cinética de expresión de FLuc después de la administración de MNP es más lenta que la administración IM (Datos ampliados, figura 10b). Esto es de esperar dado que los ARNm-LNP se disuelven de una matriz sólida en la piel a través de MNP, pero un retraso en la expresión de proteínas puede ayudar a explicar el retraso en la respuesta inmune en comparación con la dosificación de suspensión líquida. Dados los GMT máximos ligeramente más bajos, aunque similares (Fig. 3f) y sus correlatos de protección con la infección por SARS-CoV-2, las MNP de ARNm de RBD produjeron una respuesta inmune sólida dentro de un período de tiempo factible después de la administración45. Utilizamos un ensayo de electroquimioluminiscencia multiplexada para estudiar las respuestas de unión anti-RBD en suero a variantes de la proteína S del SARS-CoV-2 con diferentes mutaciones de interés para demostrar la amplitud de protección que ofrece la vacuna MNP (Fig. 3h).

Comparamos la mezcla PVP:PVA que se desarrolló para la administración de ARNm-LNP con microagujas con una suspensión de ARNm-LNP convencional administrada IM en la misma dosis, utilizando ARNm de fLuc como modelo para la expresión de proteínas en ratones. Ambos se almacenaron a temperatura ambiente y a 4 °C y se evaluaron 1 mes, 3 meses y 6 meses después in vivo. Aunque la potencia de la suspensión IM disminuye a lo largo de 6 meses, las MNP producen una luminiscencia constantemente alta durante todo el período de almacenamiento (Fig. 3i), incluso cuando se almacenan a temperatura ambiente. Las MNP también mantienen estables las mRNA-LNP cuando se almacenan a 37 °C durante 1 mes, lo que coincide con el tiempo de almacenamiento entre el cebado y el refuerzo (Datos ampliados, figura 10c). En un estudio similar, las MNP de ARNm de RBD son inmunogénicas después de al menos 3 meses de almacenamiento a temperatura ambiente y 4 °C (Datos ampliados, figura 10d), cuando se usan como refuerzo para ratones BALB/c preparados con suspensión de ARNm-LNP.

Administrar una dosis suficiente de vacuna LNP con MNP es un desafío debido a la masa polimérica necesaria para estabilizar las LNP. Utilizando el volumen de la aguja y la eficiencia de carga de MNP del estudio máximo de títulos anti-RBD, diseñamos un modelo (Fig. 3j y Nota complementaria 4) que predice la combinación de volumen y cantidad de microagujas necesarias para administrar Moderna (mRNA-1273) completo. ) o dosis de la vacuna COVID-19 de Pfizer-BioNTech (BNT162b1). El modelo predice que 360 ​​y 108 de las microagujas piramidales y la formulación estudiadas administrarían la dosis completa de las vacunas Moderna y Pfizer-BioNTech, respectivamente. Las MNP que contienen una dosis suficiente miden menos de 2 cm de ancho.

Aunque las magnitudes de las respuestas humorales son similares, observamos diferencias interesantes entre la administración IM de suspensión de ARNm-LNP y la administración ID de ARNm-LNP utilizando MNP. Los ARNm-LNP que incorporan el lípido 5 superaron a aquellos con cKK-E12 en términos de expresión de proteínas (Fig. 2h), lo que sugiere que los MNP pueden ser sensibles a la composición de lípidos ionizables. Los lípidos ionizables gobiernan la expresión y la orientación de las proteínas y se han optimizado para diversos órganos y rutas de administración34,35,46,47. Las respuestas humorales también se desarrollan IM más rápidamente (Fig. 3g). Investigaciones anteriores sobre vacunas basadas en microagujas sugieren una conexión entre el método de administración y la cinética de la respuesta humoral48,49. Esto puede reflejar la disolución más lenta de la matriz MNP (Datos ampliados, figura 10b) o diferencias fundamentales entre la administración ID e IM. Estas diferencias resaltan oportunidades para investigar y diseñar más a fondo la potencia de los ARNm-LNP entregados por las MNP. Además, las construcciones de ARNm de RBD pueden justificar estudios adicionales como objetivo para vacunas con mayor estabilidad50.

Las MNP que contienen ARNm-LNP ofrecen nuevas oportunidades para optimizar la administración de vacunas y mejorar la eficacia de las mismas. La administración ID de virus atenuados, partículas similares a virus y otras vacunas puede permitir ahorrar dosis en comparación con las rutas IM o subdérmica51,52. En una reunión del Grupo Asesor Estratégico de Expertos de la Organización Mundial de la Salud se recomendó la entrega de vacunas por identificación como medio para reducir el costo de la vacuna contra la polio, y en la India se autorizó para uso de emergencia una vacuna de ADN administrada por identificación mediante un inyector a chorro53,54. Las vacunas estables a temperatura ambiente facilitarían enormemente su implementación en el mundo en desarrollo, donde la cadena de suministro necesaria para el transporte de frío puede ser inadecuada. También permitirían almacenar vacunas de manera rentable en preparación para un posible brote55. El despliegue de las vacunas contra la COVID-19, en particular, se ha visto obstaculizado por su escasa vida útil y la dependencia de sistemas de transporte y almacenamiento en cadena de frío. Hasta ahora, hasta donde sabemos, no se han desarrollado vacunas termoestables de ARNm-LNP33,56, quizás debido a su naturaleza nanoparticulada (por ejemplo, área superficial muy alta) y su tendencia a agregarse irreversiblemente, lo que las hace excepcionalmente difíciles de estabilizar en un ambiente seco. formulación33,57,58,59.

Mostramos que las vacunas MNP impresas por MVP pueden almacenarse a temperatura ambiente y usarse para inmunizaciones meses después de su fabricación. Por el contrario, ciertas vacunas de ARNm actuales deben mantenerse entre -60 °C y -80 °C para almacenamiento a largo plazo y a 4 °C para almacenamiento a corto plazo. Los datos de modelado sugieren que una dosis humana de la vacuna mRNA-LNP COVID-19 se puede formular en un parche de microaguja de 2 cm cuadrados (Fig. 3j). Esto supone que el espacio entre agujas se mantiene a medida que aumenta el tamaño del parche, pero, para una eventual traslación, se debe evaluar la penetración en la piel y la disolución de la aguja de un parche más grande. Se necesitará ingeniería adicional del MVP para desarrollar un proceso de fabricación de microagujas de extremo a extremo para su aplicación en humanos, incluido un recinto aséptico para reducir la carga biológica y un paso de envasado integrado60,61. Creemos que el dispositivo podría adaptarse fácilmente a cualquier vacuna de ARNm para enfermedades de interés en regiones específicas y dimensionarse de acuerdo con la escala deseada de producción de vacunas MNP.

El MVP fue diseñado con el requisito de integrar y automatizar las funciones necesarias para convertir los ingredientes necesarios para fabricar MNP en MNP terminados con un nivel mínimo de habilidad del operador y en un factor de forma adecuado para el transporte. El diseño resultante constaba de tres funciones principales: carga, dosificación y secado. Estas tres funciones se organizaron en el MVP (Datos extendidos, figura 3f) y se programaron para funcionar simultáneamente. Toda la programación relacionada con MVP fue implementada en el lenguaje de programación EPSON RC 7.0 SPEL. Se requiere que el operador cargue los moldes, llene los depósitos para la formulación líquida y el respaldo de polímero y descargue los MNP.

Se desarrolló una función operativa clave de modo que, durante la etapa de dispensación, la formulación líquida primero se dispensa sobre el molde del MNP y luego se introduce dentro de la cavidad negativa del molde usando vacío debajo (lo que toma aproximadamente 15 minutos), y luego la etapa de carga se mueve a la estación de secado donde se sella su atmósfera para acelerar el tiempo de secado.

La etapa de dispensación consta de una bomba de jeringa (Harvard PHD 2000) y un brazo robótico (Epson T3) que sostiene un par de boquillas (agujas de calibre 18 para soluciones de tinte, calibre 25 para impresión de vacunas) conectadas mediante tubos a la bomba de jeringa. El movimiento del brazo robótico se programó para sincronizarse con la bomba de jeringa. El movimiento del brazo robótico/bomba se optimizó para maximizar la cobertura del molde MNP por la formulación líquida. Se impuso un intervalo de tiempo de dispensación entre cada dos MNP adyacentes para minimizar el goteo entre parches y el desperdicio de vacunas.

Ambos procesos se basaron en diferentes secuencias de aplicación de vacío en moldes de PDMS y dispensación de la solución polimérica (cargada con tinte o agentes biológicos), seguido de secado al vacío. En el primer proceso (desgasificación), se aplicó inicialmente vacío en moldes de PDMS vacíos, seguido de la dispensación de la solución de polímero dentro de un tiempo específico (~7 min) justo después de la aplicación del vacío, y finalmente se secó la solución de polímero con vacío. La desgasificación al vacío facilitó la difusión de la solución de polímero en las cavidades de microagujas en el molde PDMS (Datos ampliados, figura 1b y video complementario 1). En el segundo enfoque, se dispensó una solución de polímero en el molde PDMS y posteriormente se aplicó vacío tanto desde abajo como desde arriba de las láminas (Datos ampliados, figura 1a y video complementario 2) para inducir la difusión del polímero pero también acelerar el tiempo de secado. sin formación de burbujas. Al secar la solución al vacío, es importante mantener el gradiente de presión a través del molde PDMS manteniendo una presión negativa más alta debajo de la hoja de PDMS. Al hacerlo, el aire disuelto en la solución de polímero y vacuna se conduce hacia abajo (hacia la cámara de vacío debajo del molde PDMS), lo que evita la formación de burbujas durante el secado. Debido a la simplicidad de la automatización, el segundo enfoque se implementó en el dispositivo.

La etapa de carga fue una matriz de moldes MNP de 10 × 10 hecha a medida, que se usó para aplicar vacío (-1 bar) debajo de las láminas de PDMS. La etapa de carga se fijó a una etapa de movimiento de un solo eje (Thorlabs) permitiendo la transferencia entre la estación de carga y la estación de secado. Antes de dispensar la formulación, se calibró la alineación de la estación de carga con la estación de dispensación.

La etapa de secado era una cámara de vacío hecha a medida que se movía verticalmente mediante una etapa de movimiento de un solo eje (Thorlabs). La cubierta para la cabeza comprendía una conexión de vacío y una bolsa desecante (Datos ampliados, figura 3c). El vacío se ajustó a -0,6 bar para acelerar el secado. Se utilizó una sola bomba de vacío tanto para la etapa de carga como para la de secado. La bomba de vacío se conectó directamente a la etapa de carga y se usó un controlador de presión para disminuir el vacío a -0,6 bar en la cubierta del cabezal. El menor vacío en la cubierta del cabezal en comparación con el interior de la etapa de carga mantuvo un gradiente de presión negativo en la lámina de los moldes de PDMS, evitando la formación de burbujas en las soluciones de MNP. Además, el controlador de presión se usó para devolver automáticamente la etapa de secado a la presión atmosférica después del secado y liberar la cámara de vacío de la etapa de carga.

Se dispensaron y secaron parches (n = 100) con el MVP para estudiar el efecto de la formulación líquida en la cobertura del parche causado por diferentes patrones de secado en MNP individuales. La formulación líquida incluía una formulación polimérica (PVP, PVA, PVP:PVA 1:1) disuelta al 20 % (p/p) en PBS y mezclada con tinte. La cobertura del parche se definió como el número de microagujas formadas con éxito después del secado dividido por el número total de parches fabricables (100). La cobertura del parche se cuantificó individualmente para cada parche bajo un microscopio óptico para cada formulación. El área de caída y la circularidad se cuantificaron mediante análisis de imágenes después de la obtención de imágenes.

Se siguió un enfoque de dispensación de dos pasos para cargar vacunas y otras cargas biológicas. En el primer paso, se aspiró la solución de vacuna al tubo dispensador a través de las agujas dispensadoras (calibre 25, BD Biosciences). La formulación líquida en el primer paso estuvo compuesta por una cierta concentración del agente biológico mezclado con PVP:PVA 1:1, 4% (p/p). Luego se dispensaron aproximadamente 36 ± 6 µl de solución de vacuna (u otras cargas) utilizando un par de jeringas de 1 ml (BD Biosciences) en el centro de los moldes de MNP en la bandeja dispensadora. Se impuso un intervalo de tiempo de 9 s entre la dispensación de cada dos MNP adyacentes para minimizar el desperdicio de vacuna durante la transferencia del robot dispensador de un molde a otro. La solución de respaldo (PVP:PVA 1:1, 20 % (p/p)) se aspiró directamente a una nueva jeringa dispensadora (de 10 ml de tamaño, BD Biosciences). En la segunda etapa se dispensó una cantidad de 48 ± 6 µl de la solución de soporte justo encima de las manchas de vacuna (secas) previamente dispensadas. Antes y después de cada ronda de dispensación, las agujas y los tubos se lavaron con etanol (70%) seguido de agua esterilizada. En algunos experimentos, se dispensaron conjuntamente un par de cargas de modo que cada jeringa/aguja dispensara una carga diferente. En este caso se siguió el mismo procedimiento de carga/dispensación que en la monodispensación, excepto que cada jeringa se cargó con una carga diferente.

Se utilizó SolidWorks 2021 (Dassault Systèmes) para ilustraciones 3D del MVP, el brazo robótico, la estación dispensadora, los dispositivos de vacío, la cámara de presión negativa, el contenedor de ambiente estéril, la rejilla de secado, la cinta transportadora y la estación automática de desmoldeo de parches con microagujas. El dibujo del brazo robótico Epson T3 se descargó directamente del sitio web oficial de Epson. Los modelos de trazador XYZ, rejilla de secado y cinta transportadora se descargaron de GrabCAD. Todas las demás piezas se diseñaron a medida en referencia a las dimensiones reales de las piezas del prototipo.

Se siguió un enfoque de diseño de experimentos (DOE) para estudiar sistémicamente el efecto de varios parámetros de diseño en el tamaño colectivo de las gotas, como respuesta de salida, dispensada en una matriz de PDMS individual desde la boquilla robótica (aguja). Con este fin, se construyó un diseño de experimento de matriz ortogonal L18 (Taguchi DOE) en software (Minitab). Se estudió el efecto de los siguientes parámetros de diseño: (1) conexión de un filtro de 0,2 µm a la boquilla, (2) calibre de la aguja, (3) altura de dispensación, (4) caudal de dispensación y (5) viscosidad del polímero como Función de la composición polimérica. El área de caída proyectada del total de gotas al final de cada dispensación se cuantificó utilizando el software ImageJ. Los resultados (n = 3–5) se analizaron en Minitab para encontrar la respuesta media del área de caída en función del cambio en estos parámetros. En la figura 3g de datos ampliados se muestra una ilustración esquemática de la configuración experimental. El volumen total dispensado se consideró constante e igual a 200 µl. Se lograron diferentes caudales manteniendo constante el volumen total dispensado (200 µl) pero variando la duración de la dispensación.

Las MNP se imprimieron utilizando el MVP automatizado y se tomaron imágenes con un microscopio óptico para determinar si las microagujas eran de longitud completa y afiladas (n = 30). Se utilizó análisis de imágenes para estimar la altura de la aguja.

Se utilizó microscopía electrónica de barrido (SEM) para obtener imágenes de las microagujas fabricadas. Inicialmente, las muestras se recubrieron con una fina capa de Au/Pd utilizando un sistema de pulverización catódica Hummer 6.2 (ANATECH) y luego se tomaron imágenes utilizando un SEM JSM-5600LV (JEOL) con un voltaje de aceleración de 5 a 10 kV.

Se utilizaron positivos de acero MNP para generar moldes negativos hechos de PDMS (Sylgard 184, Dow Corning), que se mezcló según las instrucciones del fabricante y se curó durante la noche a 60 °C. Para crear positivos MNP adicionales, se introdujeron adhesivos ópticos Norland 61 curables con UV en los moldes negativos de PDMS usando una centrífuga a 3234 g durante 1 min, se colocaron en un horno de curado UV a temperatura ambiente durante 20 min y se retiraron manualmente.

Para crear una bandeja de moldes negativos, primero se alinearon los positivos de MNP utilizando una rejilla acrílica de 5 × 5 cortada con láser. Luego, se vertió el adhesivo óptico Norland 61 entre las réplicas positivas de resina individuales, se curó con luz UV a temperatura ambiente durante 20 minutos y luego se mantuvo a 60 °C durante la noche. La bandeja resultante de MNP positivas de 5 × 5 espaciadas uniformemente (Datos extendidos, Fig. 3d) se usó para fabricar una hoja PDMS de 5 × 5 de moldes negativos (Datos extendidos, Fig. 3e). Se utilizó PDMS para cubrir los positivos de resina alineados y crear una capa adicional de 1 mm de PDMS sobre los positivos. La lámina se niveló, se curó durante la noche a 60 °C y se eliminó usando isopropanol para ayudar a separar el negativo del positivo.

Las MNP se fabricaron cargando y secando 200 µl de una solución de PVP, PVA o PVP:PVA al 20% p/p en un molde PDMS. Cuando se cargaron tinte, LNP, ADN o proteína en el MNP, se utilizó un procedimiento de carga de dos pasos. Primero, se cargaron y seco. Luego, se usó un volumen variable de PVP:PVA 20% p/p en agua desionizada o PBS para llevar la masa total de MNP a 40 mg de PVP:PVA. Esa solución de polímero se cargó y se secó para crear un soporte de polímero delgado. Todas las MNP utilizadas en estudios in vivo se fabricaron mediante dispensación manual a menos que se especifique lo contrario. Todas las MNP cargadas con LNP, ADN o proteína se fabricaron aplicando vacío a través del molde usando el patrón con líneas a -1 bar de presión manométrica y aplicando vacío en la cámara de secado a -0,6 bar de presión manométrica.

Para el método de fabricación en un solo paso, se mezclaron 40 mg de PVP:PVA con varias cantidades de proteína y se agregaron en un solo paso.

El tiempo necesario para cargar tinta en el molde negativo de PDMS se evaluó registrando la carga con un microscopio electrónico (n = 3). El microscopio se colocó en el costado del molde PMDS y se enfocó en las microagujas a través del PDMS transparente.

La solución de polímero se cargó en moldes de PDMS que se desgasificaron bajo varios valores de vacío de 0 a -0,5 bar de presión manométrica durante varios períodos de tiempo. El tiempo entre la desgasificación y la carga varió de 5 a 10 minutos a 1 h. Luego las MNP se secaron y se retiraron del molde PDMS. Se adquirieron imágenes ópticas de la solución de polímero-tinte que se movía hacia el molde PDMS 0 min, 2 min, 5 min y 10 min después de agregar la solución al molde. A partir de estas imágenes, se estimó la altura de la aguja mediante análisis de imágenes.

Las soluciones de polímero (n = 1) se caracterizaron utilizando un reómetro TA Instruments Discovery HR-2 usando una placa paralela de 40 mm y una rampa de velocidad de corte de 0,01 s-1 a 5000 s-1.

Se cortaron y disolvieron en agua DI (n = 6) agujas de una MNP cargadas con 50 µg, 100 µg o 200 µg de BSA y 0,8 mg, 4 mg u 8 mg de PVP:PVA (para carga de punta en dos pasos). Se utilizó un ensayo de ácido bicinconínico (BCA) (Thermo Fisher Scientific) para cuantificar la carga de proteínas utilizando el procedimiento estándar para una placa de 96 pocillos. Se añadió un estándar interno de PVP y PVA a la curva de calibración para tener en cuenta su interferencia. La cantidad de PVP y PVA añadida a la curva de calibración se calculó en base al volumen de la aguja (0,08 mm3), una densidad de 1,2 g/cm3 y el número de agujas utilizadas para la cuantificación de BSA (ajustada a la dilución).

Para comparar la eficiencia de carga entre la fabricación manual y automatizada, se cortaron y disolvieron agujas de un MNP cargado con 100 µg de ADN y 1,6 mg de PVP:PVA (carga de punta en dos pasos) en tampón Tris-EDTA (TE) (n = 8). El ADN se cuantificó mediante absorción UV a 260 nm y 280 nm utilizando un NanoDrop. Debido a que la PVP también absorbe en el rango UV, se añadió la misma cantidad de PVP a la curva de calibración para tener en cuenta su contribución. La cantidad de PVP a agregar se calculó de la misma manera que se describe en la cuantificación de proteínas y asumiendo una proporción de PVP a PVA de 1:1. Esto se repitió para el mapa de calor de posición de la bandeja y el cálculo de la eficiencia de carga con ADN, pero se usaron 10 µg de ADN y 2 mg de PVP:PVA por parche.

Los ARNm purificados se obtuvieron con tapa CleanCap AG, sustitución completa de N1-metil-pseudouridina y cola poliadenilada (120 A) (TriLink BioTechnologies). Se utilizaron varios lípidos de alta pureza para la síntesis de LNP, incluidos 3,6-bis({4-[bis(2-hidroxidodecil)amino]butil})piperazina-2,5-diona (cKK-E12, Organix), heptadecano- 8-((2-hidroxietil)(8-noniloxi)-8-oxoctil)amino)octanoato de 9-ilo (Lipid 5, Organix), 1-2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (DOPE, Avanti), colesterol (Sigma-Aldrich) y 1-2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[metoxi(polietilenglicol)-2000] (sal de amonio) (C14-PEG2000, Avanti). Los LNP se prepararon utilizando procedimientos descritos previamente34,35,36. Los lípidos se disolvieron en etanol en una proporción molar de 35:16:46,5:2,5 cKK-E12:DOPE:colesterol:C14-PEG2000 o 38,4:12,3:47,4:1,9 Lípido 5:DOPE:colesterol:C14-PEG2000 cuando se usó cKK- E12 o Lípido 5 como lípido ionizable, respectivamente. Para preparar las LNP, la solución etanoica se añadió rápidamente y se mezcló con una solución de ARNm tamponada con citrato a pH 3 en una proporción de volumen de 3:1 (acuosa:etanol). Cuando se usó cKKe12, la proporción en peso de lípidos ionizables a ARNm se estableció en 10 y la concentración final de ARNm fue de 0,1 mg ml-1. Cuando se usó Lípido 5, la proporción en peso de lípido ionizable a ARNm se estableció en 5 y la concentración final de ARNm fue de 0,135 mg ml-1. Todos los ácidos nucleicos se almacenaron a -80 °C y se dejaron descongelar en hielo antes de su uso. Luego, las LNP se dializaron durante al menos 2 h en PBS a 4 °C en un casete de corte de peso molecular (MWCO) de 20.00034. Para LNP en agua DI, la solución se dializó contra agua DI durante un mínimo adicional de 2 h a 4 °C. Cuando fue necesario, las LNP se concentraron en un filtro Amicon mediante centrifugación a 3000 g42. Todas las soluciones se mantuvieron a 4 °C y se utilizaron en 1 semana.

La concentración de ARNm y la eficiencia de encapsulación en las LNP se estimaron con un ensayo Quant-iT RiboGreen (Thermo Fisher Scientific) utilizando un procedimiento modificado descrito en otro lugar (n = 3 por lote)34. En resumen, los LNP se diluyeron en TE o TE mezclados con tampón Triton X-100 (TX). Luego, se utilizó el ensayo Quant-iT RiboGreen para cuantificar el ARNm que no está encapsulado (cuando se diluye con TE) y la concentración total de ARNm (cuando se diluye con TX). Para determinar el tamaño, las LNP se diluyeron 200 veces en PBS y se caracterizaron utilizando un Zetasizer Nano-NS (Malvern Instruments). Al medir la carga de ARNm en MNP, se cortaron microagujas y se disolvieron en TE y TX. Al medir el ARNm cargado en el soporte de MNP, se cortaron las microagujas y el MNP restante se disolvió en TE y TX. Restar el ARNm no encapsulado del ARNm total produjo la concentración de ARNm encapsulado.

Los polímeros se disolvieron en PBS o agua desionizada a una concentración que oscilaba entre el 10% y el 30% p/p dependiendo de su solubilidad (n = 4). Luego, estas soluciones se pesaron y se mezclaron con una suspensión de LNP para alcanzar la proporción de masa adecuada de polímero y ARNm. La mezcla de tinta se secó inmediatamente en un tubo LoBind Eppendorf en un desecador a un vacío de -0,5 bar. Después de 24 h de secado, el sedimento de tinta se redisolvió en PBS y se incubó durante 10 min a 37 °C. Se usó PBS para ajustar el volumen de modo que 15 µl de tinta disuelta contengan 50 ng de ARNm encapsulado. Esta mezcla se usó para transfectar células. El lípido ionizable utilizado fue cKK-E12.

Para la evaluación in vitro de MNP cargadas con LNP, se fabricaron cuatro MNP utilizando la carga de dos pasos, 10 µg de ARNm y 8 mg de PVP:PVA para la carga de la punta. Se utilizaron dos MNP para cuantificar la carga de la punta de LNP y dos MNP para transfectar células HeLa. Las agujas se cortaron y se disolvieron en 1 ml de tampón TE para la cuantificación del ARN y en 1 ml de DMEM para la transfección celular. Se utilizó el procedimiento descrito en la síntesis de LNP para cuantificar el ARNm y se transfectaron células HeLa como se describe a continuación. El lípido ionizable utilizado fue el lípido 5.

Las células HeLa se cultivaron en DMEM con alto contenido de glucosa con rojo fenol (Invitrogen) suplementado con 10% de FBS (Invitrogen) y 1% de antibiótico (Invitrogen). Luego, se sembraron 10.000 células en pocillos de una placa blanca de 96 pocillos en medio de crecimiento completo. Veinte horas después de la siembra, se agregaron al medio de crecimiento 15 µl de LNP frescos o formulación disuelta, o 50 µl de LNP frescos o MNP disueltos. En todos los casos, se agregaron 50 ng de ARNm encapsulado a cada pocillo. Veinticuatro horas después de la transfección, se agregaron 100 µl del reactivo Bright-Glo Luciferase Assay Kit (Promega) y se midió la luminiscencia en los siguientes 2 minutos usando un lector de placas Tecan Infinite 200 PRO.

La viabilidad de las células HeLa se midió en presencia de 0,6 mg de formulación polimérica y 50 ng de ARNm encapsulado en LNP elaborados con cKK-e12 como lípido ionizable. En cada pocillo se utilizaron quince microlitros de tinta. La viabilidad celular se midió en una placa de 96 pocillos utilizando un ensayo CKK8 como lo describe el fabricante (ab228554).

El MNP se fabricó utilizando la carga en dos pasos, utilizando 10 µg de ARNm y 8 mg de PVP:PVA en el primer paso. Cada una de las 100 agujas del MNP se cortó manualmente en su base bajo un microscopio y se clasificó según su posición en la matriz. El ARN se cuantificó de la misma manera que se describe en la sección de síntesis de LNP. El lípido ionizable utilizado fue el lípido 5.

Se utilizaron FLuc mRNA-LNP para todas las muestras. Las LNP se analizaron (1) después de la diálisis en PBS, (2) después de concentrarlas a 320 μg ml-1, (3) después de diluirlas a 200 μg ml-1 en una solución de polímero al 4 % p/p para formar tinta de vacuna y (4) después del secado para formar MNP. Las muestras se disolvieron en 20 µl, se agitaron durante 2 s, se diluyeron con 200 µl adicionales y se mezclaron. Luego, se diluyeron 10 µl de ARNm-LNP reconstituidos en 490 µl de agua, se agitaron durante 2 segundos y luego se analizaron utilizando dispersión dinámica de luz (DLS) en un Zetasizer Nano-NS (Malvern Instruments). Las muestras (n = 5 por grupo) se equilibraron durante 60 s antes de la medición. Se realizaron tres réplicas técnicas para cada muestra.

Se utilizaron FLuc mRNA-LNP para todas las muestras. Las LNP se analizaron (1) después de la diálisis en PBS (2), después de concentrarlas a 320 μg ml-1 (3), después de diluirlas a 200 μg ml-1 en una solución de polímero al 4 % p/p para formar tinta de vacuna y (4) después del secado para formar MNP. Se agregaron muestras disueltas a las rejillas TEM de cobre recubiertas de carbono y se secaron para eliminar el exceso de solución. A continuación, las muestras se tiñeron usando una solución acuosa de ácido fosfotúngstico al 1%; se eliminó el exceso de solución colorante; y las muestras se secaron a temperatura ambiente antes de obtener imágenes TEM. Para obtener imágenes criogénicas-TEM, las muestras se congelaron por inmersión utilizando un 930 Gatan Cryoplunge 3. Se tomaron imágenes de todas las muestras utilizando un microscopio JEOL 2100 FEG con un voltaje de aceleración de 200 kV.

Se utilizaron FLuc mRNA-LNP para todas las muestras. El ARNm se analizó (1) según lo proporcionado por el fabricante, (2) después de la síntesis de ARNm-LNP y diálisis en PBS, (3) después de diluir a 200 μg ml-1 en una solución de polímero al 4% p/p para formar tinta de vacuna y ( 4) después del secado para formar MNP. Luego, se analizaron 2 µl de muestras disueltas utilizando un Agilent Femto Pulse utilizando el kit de ARN de ultra sensibilidad (FP-1201). Las muestras se prepararon utilizando tampón TE o TX.

El contenido de agua de las MNP fabricadas en diferentes momentos y etapas de secado se cuantificó mediante análisis termogravimétrico (TGA) utilizando un analizador termogravimétrico Pyris 1 (PerkinElmer) con una velocidad de calentamiento de 20 °C por minuto de 50 °C a 600 °C en condiciones flujo de nitrógeno (20 ml min-1) (n = 3). El contenido de agua se evaluó analizando únicamente las agujas de las MNP colocadas en recipientes de cerámica y no el respaldo. La velocidad de secado se estimó mediante una regresión lineal del contenido de agua medido a lo largo del tiempo durante todo el proceso de secado. Todos los análisis se realizaron por triplicado.

Para las pruebas de compresión, se montó un único MNP entre placas de compresión (Serie Instron 2501) y se comprimió a una velocidad de 1 mm min-1 usando un Instron 5943 con una celda de carga de 500 N (n = 10). Se informó la fuerza máxima antes de la falla de la microaguja y la pendiente de la región lineal de compresión inicial. El modo de falla de las microagujas se determinó mediante imágenes de los parches después de la prueba.

Las MNP se aplicaron ex vivo sobre piel de cerdo extirpada utilizando un mini aplicador con resorte (Micropoint Technologies) durante 2 min, 5 min, 10 min o 30 min (n = 3). Posteriormente, las muestras de piel se fijaron en formalina durante 48 h y luego se transfirieron a etanol al 70% y se incluyeron en cera de parafina. Las muestras fueron seccionadas y teñidas con hematoxilina y eosina.

Para cuantificar la disolución de las microagujas en función del tiempo de aplicación, se tomaron imágenes de los parches de microagujas antes y después de la aplicación sobre piel de cerdo extirpada utilizando un Leica DFC450. Los parches se colocaron de manera transversal para obtener imágenes utilizando el software LAS versión 4.7. La longitud de las microagujas se calculó utilizando ImageJ para al menos 10 microagujas de cada parche, y estas mediciones se realizaron en tres parches por punto de tiempo.

Todos los procedimientos con animales fueron aprobados y realizados según las pautas del Comité de Cuidado de Animales del Instituto de Tecnología de Massachusetts (1019-061-22). Se utilizaron ratones C57BL/6 hembras de seis a ocho semanas de edad (Charles River Laboratories) y se controlaron su seguridad (n = 5). Las MNP se fabricaron con ARNm-LNP que codifican FLuc (L-7010, TriLink BioTechnologies) utilizando el método de carga de dos pasos descrito anteriormente. Se variaron la dosis de LNP y la química de los lípidos ionizables, manteniendo al menos una relación de masa de polímero:ARNm de 100:1. Se estudiaron dos lípidos ionizables que fueron previamente seleccionados para métodos de administración de ARNm IV o IM, respectivamente: cKK-E12 (ref. 34) y Lípido 5 (ref. 35). Se aplicaron MNP a cualquiera de las almohadillas plantares con anestesia. Para disolver más completamente la dosis completa de LNP transportada en una MNP, cuando se aplicó una matriz de 10 × 10, las MNP se dividieron en dos mitades y se aplicaron consecutivamente a la misma almohadilla plantar, durante 10 minutos por mitad. Se aplicó presión con la mano durante el primer minuto y luego se aseguró el MNP a la almohadilla del pie usando cinta adhesiva durante los 9 minutos restantes. Como control positivo, se administraron LNP al músculo caudal del muslo como una suspensión de 40 µl en PBS en dosis equivalentes. Se seleccionó la almohadilla plantar porque se ha utilizado previamente para la obtención de imágenes IVIS de luminiscencia después de la aplicación de microagujas37 y porque es un sitio bien estudiado para la administración ID de vacunas, lo que permite el aislamiento del ganglio linfático de drenaje62,63.

Veinticuatro horas después de la aplicación de MNP, se tomaron imágenes de bioluminiscencia de los ratones en un sistema de imágenes cinéticas IVIS (PerkinElmer). Luego, 15 minutos antes de la obtención de imágenes, se inyectó a los ratones por vía intraperitoneal RediJect D-Luciferin Ultra (PerkinElmer) a 150 mg kg-1. La luminiscencia se cuantificó utilizando el software LivingImage (PerkinElmer). La comparación entre los resultados de luminiscencia debe considerarse cuidadosamente porque la absorción de luz, la difusión y la profundidad de administración de la luz en el lugar de la inyección pueden afectar la señal medida con IVIS. Para el experimento de cinética, las imágenes se realizaron a las 2 h, 6 h, 24 h, 48 h y 72 h después de la administración.

En total, se sembraron 89.000 células HEK293 por pocillo de un portaobjetos de cultivo de cuatro pocillos BioCoat Poly-D-Lysine (354577). Se utilizó el mismo medio de crecimiento que las células HeLa. Veinticuatro horas después de la siembra, las células se transfectaron con 265 ng de ARNm por pocillo de una suspensión de LNP elaborada con lípido 5 y ARNm encapsulado que codifica RBD. También se utilizaron LNP disueltas de una MNP para demostrar la bioactividad después de cargarlas en MNP. Se utilizaron los mismos MNP que se utilizaron en el estudio de vacunación contra el SARS-CoV-2. Se cortaron agujas, se disolvieron en DMEM y se usaron para transfectar células usando la misma masa de ARNm que la suspensión de LNP de control. El ARNm se cuantificó disolviendo agujas de una réplica independiente de MNP en tampón TE y utilizando el procedimiento descrito en la síntesis de LNP (también se agregaron PVP y PVA como estándares internos a la curva de calibración de ARN de RiboGreen). Cuarenta y ocho horas después de la siembra, las células se lavaron dos veces con PBS a 37 °C. Las células se lavaron con PBS entre todos los pasos posteriores. Las células se dejaron equilibrar a temperatura ambiente durante 15 min. Luego, se añadió 1 ml de solución fijadora Image-iT (Invitrogen) por pocillo (FB002) y se dejó durante 15 minutos. A continuación, se añadió 1 ml de tampón de permeabilización y fijación intracelular eBioscience (Invitrogen) y se dejó incubar durante 10 minutos. Luego, se añadió 1 ml de BSA al 1% (p:v) en PBS durante 1 h a temperatura ambiente. Luego, se agregaron a cada pocillo 300 µl de anticuerpo monoclonal humano recombinante de proteína de pico (RBD) del SARS-CoV-2 (T01KHu, Thermo Fisher Scientific, 703958) diluido 100 veces en PBS y se dejaron incubar durante 1 h. Se utilizó PBS-Tween para lavar las células. A continuación, se usaron 300 µl de anticuerpo secundario de adsorción cruzada anti-IgG humana (H+L) de cabra, Alexa Fluor 488 (Thermo Fisher Scientific, A-11013), diluido 400 veces en PBS como anticuerpo secundario y se incubaron durante 1 h. Luego, se usaron 300 µl de tinción con rodamina-faloidina (Invitrogen R415) diluidos 400 veces en BSA al 1% para obtener imágenes del citoesqueleto celular y se incubaron durante 30 minutos. Finalmente, las células se fijaron utilizando una gota de DAPI ProLong (Invitrogen, P36982). Se tomaron imágenes de las células en un microscopio confocal (Olympus FV1000).

Todos los procedimientos con animales fueron aprobados y realizados según las pautas del Comité de Cuidado de Animales del Instituto de Tecnología de Massachusetts (1019-061-22). Se utilizaron ratones C57BL/6 hembras de seis a ocho semanas de edad (Charles River Laboratories) y se controlaron su seguridad (n = 5). Las MNP se fabricaron con ARNm-LNP con codones humanos optimizados que codifican el RBD del SARS-CoV-2 y un motivo de trimerización T4, utilizando el método de carga de dos pasos descrito anteriormente. Se fabricaron matrices de MNP más pequeñas que contenían 1,5 µg de ARNm encapsulado, lo que se verificó mediante cuantificación de ARNm. Se aplicaron cuatro MNP con aproximadamente 12 microagujas a las almohadillas plantares izquierda y derecha de ratones con anestesia, con un tiempo de aplicación de 10 minutos para cada una, para una dosis total de ARNm encapsulado de 6,0 µg por ratón. Se aplicó presión con la mano durante el primer minuto y luego se aseguró el MNP a la almohadilla del pie usando cinta adhesiva durante los 9 minutos restantes. Como control positivo, se administraron LNP al músculo caudal del muslo derecho como una suspensión de 40 µl en PBS a 10,0 µg de ARNm encapsulado por ratón.

Todos los procedimientos con animales fueron aprobados y realizados según las pautas del Comité de Cuidado de Animales del Instituto de Tecnología de Massachusetts (1019-061-22). Las MNP se fabricaron con LNP de ARNm de FLuc utilizando el método de carga de dos pasos descrito anteriormente, a una dosis de ARNm de 1,0 µg por parche con una relación de masa de polímero:ARNm de 500:1. Se utilizó el lípido 5 como lípido ionizable. El tamaño y la aplicación de MNP son idénticos a los estudios anteriores de expresión de fLuc (n = 5). Las MNP se almacenaron en un recipiente con desecante de sílice a varias temperaturas. Como control positivo, se almacenaron viales sellados de suspensión que contenían la misma cantidad de ARNm de fLuc en LNP elaborados con Lípido 5 a varias temperaturas junto con las MNP.

Se utilizó un kit de detección ELISA SARS-CoV-2 Spike S1-RBD (L00845, GenScript). Las placas se recubrieron con antígeno recombinante purificado Spike S1-RBD del SARS-CoV-2. Las placas se incubaron con diluciones seriadas de sueros inactivados por calor y se incubaron a 37 °C durante 30 min. Se utilizó una dilución 1:10.000 de conjugado de peroxidasa de rábano picante-IgG anti-ratón de conejo (Abcam, ab6728) como anticuerpo secundario y se utilizó 3,5,3',5'-tetrametilbencidina (TMB) como sustrato. Los títulos de punto final interpolados se calcularon como la dilución que emitió una densidad óptica superior a 3 veces el fondo producido por el suero de ratones sin tratamiento previo.

Se diseñaron y produjeron placas ECLA (Meso Scale Discovery SARS-CoV-2 IgG, N05CA-1, Panel 7) con cuatro manchas de antígeno en cada pocillo. Los antígenos incluidos fueron WA1/2020, B.1.1.7, P.1 y B.1.351 S1-RBD. Las placas se bloquearon con 50 µl de solución de BSA al 1 % durante al menos 30 min a temperatura ambiente con agitación a 700 rpm. Durante el bloqueo, el suero se diluyó 1:5000 con Diluyente 100 (Meso Scale Discovery). Las placas se lavaron con 150 µl de tampón de lavado y se secaron, y se añadieron por duplicado 50 µl de muestras diluidas a las placas. Las muestras se incubaron a temperatura ambiente con agitación a 700 rpm durante 2 h. El anticuerpo secundario se preparó utilizando el anticuerpo de detección de IgG anti-ratón de conejo Jackson ImmunoResearch (315-005-045) conjugado con MSD GOLD SULFO-TAG mediante química NHS-Ester según las pautas del fabricante (R91AO-1). Las placas se lavaron nuevamente tres veces y se agregaron a cada pocillo 50 µl de anticuerpo de detección de IgG anti-ratón marcado con SULFO diluido a 1x en Diluyente 100 y se incubaron durante 1 h con agitación de 700 rpm. Las placas se lavaron tres veces; Se añadieron a cada pocillo 150 µl de tampón de lectura B MSD GOLD; y las placas se leyeron en un MESO Quick-Plex SQ 120. Los títulos de MSD para cada muestra se informaron como unidades relativas de luz (RLU), que se calcularon como muestra menos blanco para cada punto y muestra. El límite de detección se definió como 500 RLU para todos los ensayos.

Las MNP que contenían 1,5 μg de ARNm de SARS-CoV-2 encapsulado se almacenaron en un recipiente con desecante de sílice a varias temperaturas. Como control positivo, se almacenaron viales sellados de suspensión que contenían ARNm-LNP del SARS-CoV-2 a 200 µg ml-1 a ​​varias temperaturas junto con las MNP. Se utilizaron ratones BALB/c hembra de seis a ocho semanas de edad (Charles River Laboratories) y se controlaron su seguridad (n = 5). Todos los ratones recibieron una dosis principal de 10 µg de ARNm encapsulado en ARNm-LNP administrado al músculo caudal derecho del muslo como una suspensión de 40 µl en PBS. Luego, los ratones fueron reforzados con diversos materiales, incluidos controles nuevos y parches o suspensión almacenados durante 1 o 3 meses. Para los grupos de MNP, como en experimentos anteriores, se aplicaron cuatro MNP con 12 microagujas en las almohadillas plantares izquierda y derecha de ratones con anestesia, con un tiempo de aplicación de 10 minutos para cada uno, para una dosis total estimada de ARNm de 6,0 µg por ratón. Para los grupos IM, se administraron 4 μg de ARNm encapsulado en ARNm-LNP en el músculo caudal del muslo derecho como una suspensión de 40 μl en PBS.

Los análisis estadísticos se realizaron utilizando el software GraphPad Prism. Los valores de P están representados por: *P ≤ 0,05; **P ≤ 0,01; ***P ≤ 0,001; ****P ≤ 0,0001.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen del informe de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Los conjuntos de datos generados y analizados durante estos estudios están disponibles del autor correspondiente previa solicitud razonable. La secuencia de RBD utilizada para este estudio está disponible en GenBank (OP839194).

Los códigos utilizados para el modelado de rendimiento y la programación de dispositivos están disponibles en un repositorio público de Zenodo (https://doi.org/10.5281/zenodo.7735167).

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Descargar referencias

Agradecemos a Meso Scale Discovery por sus generosos consejos, asistencia y reactivos. Agradecemos al Centro de Biotecnología Robert A. Swanson (1969) del Instituto Koch (RRID: SCR_018674) por el apoyo técnico, específicamente al núcleo de histología, el núcleo de materiales de nanotecnología, el biomicrocentro y las instalaciones de pruebas preclínicas y de imágenes animales. Agradecemos al Laboratorio de Materiales de Ingeniería del Departamento de Ciencia e Ingeniería de Materiales del MIT por su soporte técnico. Este trabajo fue financiado, en parte, por la subvención (básica) de apoyo del Instituto Koch P30-CA14051 del Instituto Nacional del Cáncer. Este trabajo también fue apoyado por la subvención DHHS/OS/ASPR/BARDA/DRIVe EZ-BAA-18-100-SOL-00018 de la Autoridad de Investigación y Desarrollo Biomédico Avanzado (BARDA). AVS ha recibido una beca y desea agradecer a la Fundación Educativa Belga Americana (BAEF) y a Wallonia-Brussels International por la Beca de Excelencia (WBI.World). MK recibió una beca y desea reconocer a la Fundación Bodossaki y la Fundación Onassis. Agradecemos el apoyo de los Institutos Nacionales de Salud (T32 AI0073787) a LHT

Estos autores contribuyeron igualmente: Aurélien vander Straeten, Morteza Sarmadi, John L. Daristotle.

Instituto David H. Koch para la Investigación Integrativa del Cáncer, Instituto Tecnológico de Massachusetts, Cambridge, MA, EE. UU.

Aurélien vander Straeten, Morteza Sarmadi, John L. Daristotle, Maria Kanelli, Joe Collins, Apurva Pardeshi, Jooli Han, Dhruv Varshney, Behnaz Eshaghi, Johnny García, Timothy A. Forster, Gary Li, Nandita Menon, Shahad K. Alsaiari, Robert Langer y Ana Jaklenec

Centro de Investigación de Virología y Vacunas, Centro Médico Beth Israel Deaconess, Facultad de Medicina de Harvard, Boston, MA, EE. UU.

Lisa H. Tostanoski, Catherine Jacob-Dolan, Olivia C. Powers, Kevin Hall y Dan H. Barouch

Departamento de Ingeniería Química, Instituto de Tecnología de Massachusetts, Cambridge, MA, EE. UU.

Sydney L. Pyon, Linzixuan Zhang y Robert Langer

Facultad de Medicina de Harvard, Boston, MA, EE. UU.

Catherine Jacob-Dolan y Dan H. Barouch

Instituto Ragon de MGH, MIT y Harvard, Cambridge, MA, EE. UU.

Catherine Jacob-Dolan y Dan H. Barouch

Laboratorio de Ingeniería Macromolecular, Departamento de Ingeniería Mecánica y de Procesos, ETH Zurich, Zurich, Suiza

Morris Wolf y Mark W. Tibbitt

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Conceptualización: AVS, MS, JD, MK, JC, AJ y RF Metodología: AVS, MS, JD, MK, LT, JC, AP, DV, BE, JG, TF, GL, NM, CJD, SL, LZ, OP , KH, SA y MW Investigación: AVS, MS, JD, MK, LT, JC, AP, DV, BE, JG, TF, GL, NM, SP, CJD, SL, LZ, OP, KH y MW Visualización: AVS , MS, JD y JH Adquisición de fondos: AJ, RL, AVS y MK Administración de proyectos: AVS, JD, JC y AJ Supervisión: AJ, RL, DB y MT Escritura: borrador original: AVS, MS y JD Escritura: revisión y edición : AVS, MS, JD, LT, JH, RF, DB, RL y AJ

Correspondencia a Robert Langer o Ana Jaklenec.

Para obtener una lista de entidades con las que RL está involucrada, compensada o no, consulte www.dropbox.com/s/yc3xqb5s8s94v7x/Rev Langer COI.pdf?dl=0. Para obtener una lista de entidades con las que AJ está involucrado, compensado o no, consulte https://www.dropbox.com/s/wre16lh7jr7bvoi/230410%20Jaklenec%20COI.pdf?dl=0. AVS, MS, JD, MK, JC, RL y AJ figuran como inventores en una solicitud de patente pendiente (17/903586) relacionada con la tecnología descrita. Los demás autores no declaran tener intereses en competencia.

Nature Biotechnology agradece a los revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

Consultor independiente: Robert Farra.

(a) Carga en el molde de microagujas negativas según la permeabilidad al aire de PDMS seguida del secado de la solución de polímero. Se aplica vacío debajo de la hoja de PDMS para eliminar el aire de debajo de la tinta de la vacuna a través del molde de PDMS permeable al aire. El secado se acelera aplicando también vacío encima del molde. (b) Carga en el molde de microagujas negativas según la solubilidad en aire de PDMS seguida del secado de la solución de polímero. (c) Configuraciones de dispositivos de vacío para aplicar vacío al fondo del molde PDMS. (d) Tiempo de carga de la solución de polímero para PDMS elaborado a partir de diferentes proporciones de polímero a reticulante (n = 3 muestras independientes). Se utilizó un ANOVA unidireccional ordinario (prueba de comparaciones múltiples de Sidak). (e) Imágenes de MNP de moldes PDMS que se desgasificaron bajo varios valores de vacío y se cargaron con una solución de polímero. (f) Imágenes de MNP donde se agregó la solución de polímero al molde PDMS desgasificado después de 5 a 10 minutos o 1 hora. (g – h) Progresión de la altura de la aguja a lo largo del tiempo después de dispensar la solución de polímero (n = 13–18 agujas individuales). (i – j) Altura de la aguja normalizada a partir de imágenes después de diversas condiciones de desgasificación (n = 10–18 agujas individuales). (k) Viscosidad medida para varias soluciones de polímeros utilizadas en este estudio (n = 1). Los datos representan la media ± sd Los valores de P están representados por: *P ≤ 0,05; **P ≤ 0,01; ***P ≤ 0,001; ****P ≤ 0,0001. MPa, megapascales; NS, no significativo.

(a) Imágenes de MNP elaboradas a partir de varios volúmenes de solución de PVP:PVA al 20% p/p, que minimizan el desperdicio de vacunas con un respaldo ultrafino. Las soluciones de PVP:PVA al 20% p/p se colorearon con cristal violeta. (b – c) Las imágenes de optimización del volumen de dispensación y la medición de la circularidad del respaldo seco resultaron de varias formulaciones de matrices de MNP (n = 1).

(a) Diseño CAD de las piezas acrílicas que se cortaron y montaron juntas para formar la estación de carga. Imágenes de (b) la estación de carga, (c) la cubierta de la estación de secado, (d) el positivo de MNP de 5 × 5 y (e) la hoja de PDMS de 5 × 5 de moldes de MNP negativos. (f) Una fotografía del sistema MVP con las características anotadas. (g) Esquema que representa el sistema de dispensación y la altura de dispensación. Efecto de los parámetros de dosificación: caudal (h), filtración (i), tamaño de la aguja (j) y altura de dosificación (k) sobre el tamaño de gota resultante. Todas las diferencias son significativas en (P <0,01) a menos que se indique lo contrario. Se utilizó un ANOVA unidireccional ordinario (prueba de comparaciones múltiples de Sidak) (n = 3 MNP por grupo). (l) Una imagen de 100 MNP dispensadas y secadas en una bandeja de impresión. Los datos representan la media ± DE *P ≤ 0,05; **P ≤ 0,01; ***P ≤ 0,001; ****P ≤ 0,0001. NS, no significativo.

(a) Esquema de los procesos utilizados para (a) carga en un paso y (b) carga en punta en dos pasos. Primero se dispensa una solución que contiene la vacuna y el polímero utilizando un brazo robótico encima del molde PDMS. Simultáneamente, se aplica un vacío de –1 bar debajo para cargar la solución en el molde negativo. Luego, la solución se seca bajo una atmósfera desecante y un vacío de –0,6 bar. Para la carga en un solo paso (a), se depositan en un solo paso la vacuna y suficiente polímero para formar puntas y soporte. Para la carga de puntas en dos pasos (b), la vacuna y el polímero se depositan primero solo en las puntas y luego se repite el mismo procedimiento usando solo polímero para formar el respaldo de las MNP. (c) Caracterización de microagujas afiladas, de longitud completa y correctamente formadas fabricadas por el MVP automatizado, como porcentaje del total de agujas producidas (n = 30 parches). Las MNP fabricadas tenían en promedio 37 ± 8 agujas por parche. (d) El rendimiento de dispensación es una función de la altura de la gota dispensada y el tamaño del parche, mientras que (e) el rendimiento de secado es una función del tiempo de secado y el número de agujas por parche. Ambos rendimientos son funciones de (f) tiempo de secado y (g) tamaño del parche. El paso con el rendimiento más bajo determina el rendimiento general de la impresora de vacunas con microagujas.

(a) El rendimiento de la fabricación automatizada de MNP se puede aumentar moviendo bandejas modulares de moldes de MNP a una rejilla de secado para acelerar el paso de secado de la vacuna. La aplicación de vacío para llenar el molde de microagujas puede realizarse en el dispositivo de transporte del molde (centro) o en la rejilla de la bandeja (derecha). (b) El rendimiento del secado se presenta como una función de la longitud de la bandeja y el número de bandejas en la rejilla de secado vertical. El tamaño (h) de la rejilla de secado se estimó suponiendo una altura de bandeja única de 50 mm. Al igual que el dispositivo de bandeja única, se supone que el tiempo de secado es de 48 h. (c) Los moldes de PDMS se pueden tratar previamente con una técnica de desgasificación utilizando presión negativa antes de la dispensación de la vacuna para acelerar el proceso de fabricación de MNP. Con moldes PDMS desgasificados, un brazo robótico puede dispensar solución de vacuna de forma continua. Luego, los moldes de PDMS completamente dispensados ​​se pueden trasladar a una rejilla de secado mediante una cinta transportadora. Todo este proceso estará contenido dentro de un recinto aséptico para mantener la esterilidad durante el procesamiento. (d – i) Diseño para el desmolde automatizado de parches. (d) Después de que los parches de microagujas de vacuna se sequen completamente en un molde PDMS, (e) un brazo robótico trae un respaldo acrílico con cinta de doble cara. (f) El brazo robótico alinea y fija el respaldo adhesivo acrílico a un parche de microaguja, (g) y el MNP se retira del molde PDMS a medida que el brazo robótico se eleva verticalmente. (h) La punta del brazo robótico ingresa entre una hendidura metálica diseñada para la eliminación de MNP. A medida que el brazo robótico se eleva verticalmente, la MNP se desprende de la punta del brazo del robot y cae en su embalaje (i), donde la MNP flota para evitar cualquier contacto directo con las puntas de las agujas. Los MNP desmoldados se empaquetan y almacenan en un ambiente estéril y seco hasta su uso.

Comparación de la carga de la punta (a) y la eficiencia de la carga de la punta (b) utilizando el proceso de fabricación de uno o dos pasos en función de la masa de proteína utilizada para la dispensación. (c) Comparación de la masa de polímero (PVP:PVA) utilizada con la proteína (BSA) durante el primer paso del proceso de fabricación de dos pasos. La masa de polímero baja es 0,8 mg de PVP:PVA, mientras que la masa de polímero alta es de 4 mg y 8 mg de PVP:PVA para 100 µg y 200 µg de BSA respectivamente. Se utilizó un ANOVA ordinario de dos factores (prueba de comparaciones múltiples de Sidak) (n = 6 muestras independientes). (d) Masa relativa de albúmina sérica bovina (BSA) cargada para tres lotes grandes diferentes de MNP, normalizada al promedio. La prueba de Bartlett (p = 0,006) reveló que las desviaciones estándar podían ser significativamente diferentes, y las pruebas t bilaterales entre los grupos revelaron que los parches dispensados ​​a 30 mm tenían una desviación estándar significativamente diferente de los otros dos grupos, que eran comparables a entre sí (n = 50 parches para hechos a mano; n = 40 parches para cualquiera de las alturas de dispensación estudiadas). (e) Eficiencia de carga por parche para 10 μg de una vacuna de ADN para n = 100 MNP fabricadas con el MVP. Los datos representan la media ± sd Los valores de P están representados por: *P ≤ 0,05; **P ≤ 0,01; ***P ≤ 0,001; ****P ≤ 0,0001. NS, no significativo.

(a) concentración de ARNm encapsulado, (b) eficiencia de encapsulación de ARNm y (c) diámetro de LNP elaborados con dos lípidos ionizables diferentes (cKK-e12 o lípido 5) y ARNm encapsulado que codifica fLuc o RBD (n = 3). (d) Viabilidad de las células HeLa medida en presencia de 0,6 mg de formulación y 50 ng de ARNm encapsulado en LNP elaborados con cKK-e12 (n = 4 réplicas técnicas). (e) Tiempo total de secado para MNP hechas de diferentes formulaciones poliméricas usando alcohol polivinílico (PVA) o polivinilpirrolidona (PVP10 o PVP60, peso molecular de 10 kDa o 60 kDa, respectivamente). Se estudiaron dos enfoques de secado diferentes: secado bajo flujo de nitrógeno durante 10 h antes del vacío o secado con desecante durante 24 h antes del vacío (n = 1). Los parches 100% PVP eran demasiado frágiles para sacarlos del molde sin fracturarse. (f) Rigidez y (g) fuerza máxima medidas en pruebas de compresión de MNP cargadas con ARNm-LNP hechas de diferentes polímeros. Se utilizó un ANOVA unidireccional ordinario (prueba de comparaciones múltiples de Sidak) (n = 5 por grupo). (h) diámetro de mrna-lnp medido por dispersión dinámica de luz (dls) inmediatamente después de la síntesis, después de la concentración, después de formular la tinta de la vacuna y después del secado para formar la matriz de MNP. (n = 3 por grupo). Imágenes representativas de microscopía electrónica de transmisión (TEM) y crio-TEM para (i) ARNm-LNP después de la síntesis, (j) ARNm-LNP en tinta de vacuna y (k) ARNm-LNP en parches de microagujas. (l) análisis de fragmentos de ARNm de ARNm-LNP de Fluc, ARNm de tinta de vacuna y ARNm de MNP, caracterizados mediante electroforesis capilar. (m) Distribución de ARNm encapsulado en las agujas de un parche de microagujas. (n) Histograma de carga de ARNm encapsulado por aguja. (o) Carga de ARNm encapsulado y (p) eficiencia de carga por parche (n = 2 muestras independientes). (q) Expresión de proteínas después de la transfección HeLa con LNP (6 réplicas técnicas) o las mismas LNP redisueltas del parche de microagujas (n = 2 muestras independientes, 6 réplicas técnicas por MNP). Los datos representan la media ± DE

(a) Dimensiones de una microaguja individual utilizada en parches de microagujas piramidales o cónicos. La distancia entre dos agujas adyacentes (paso) es de 1000 µm. ( b ) Imágenes ópticas representativas de la disolución de la aguja tras la aplicación ex vivo sobre piel de cerdo en función del tiempo para MNP de forma piramidal y cónica. ( c – e ) Comparación entre microagujas cónicas y piramidales hechas de PVP: PVA 2: 1 y 1: 1, en términos de volumen disuelto en piel de cerdo ex vivo. Pruebas t no apareadas de dos colas (n = 23–59 agujas por grupo). Los datos representan la media ± sd Los valores de P están representados por: *P ≤ 0,05; **P ≤ 0,01; ***P ≤ 0,001; ****P ≤ 0,0001. NS, no significativo.

(a) Esquema de la secuencia RBD del SARS-CoV-2 de las construcciones de ARNm utilizadas en este artículo. La secuencia señal (SS) está coloreada en naranja, el dominio RBD está coloreado en azul y el motivo de trimerización T4 está coloreado en verde. (bc) Los LNP que encapsulan el ARNm que codifica fLuc se mezclaron con varios polímeros solubles en agua y se secaron. Los LNP se dializaron en PBS o agua DI antes de mezclarlos con la matriz polimérica. La expresión de proteínas en células HeLa se midió después de la transfección con polímero redisuelto para detectar una combinación de polímeros que produzca una expresión de proteínas comparable a las LNP en suspensión (n = 4 réplicas técnicas). (dE) El tamaño de las gotas es fundamental para una alta eficiencia de carga de la vacuna. Debido al efecto Marangoni, un tamaño de gota más grande (d) tiene una eficiencia de carga menor que una gota pequeña (e) dispensada en el centro de un molde. (f) Células HEK transfectadas con suspensión de LNP elaborada con lípido 5 y encapsulación de ARNm que codifica RBD. Las LNP que encapsulan el ARNm que codifica RBD se disolvieron de una MNP y se agregaron para demostrar la bioactividad después de cargarlas en las MNP. RBD se muestra en verde (Alexa Fluor 488 utilizada como anticuerpo secundario), la actina se muestra en rojo (rodamina faloidina) y el núcleo en azul (DAPI). (g) Carga de punta de MNP (h) y eficiencia de carga de diferentes construcciones de ARNm-LNP utilizadas para estudios in vivo (n = 3 muestras independientes). Se administraron cuatro MNP para estudios in vivo a 1,5 μg por parche para producir una dosis teórica de 6 μg. (i) De los 6 μg de ARNm utilizados para la fabricación de MNP, evaluamos el porcentaje de ARNm recuperado en varias regiones de MNP. Aproximadamente el 25 % se encontró en las microagujas, lo que coincidía con la medición de la eficiencia de carga, y el ARNm restante se encontró en el respaldo. El total informado es la suma de las agujas y el respaldo, lo que muestra que todo el ARNm se contabilizó en el MNP (n = 5 muestras independientes). Los datos representan la media ± DE

(a) Régimen de inmunización para experimento in vivo en ratones C57BL/6. ( b ) Cinética de la expresión del ARNm de FLuc medida por luminiscencia. Se administró 1 μg de ARNm en ARNm-LNP a ratones C57BL/6 mediante inyección intramuscular (IM) o aplicación de parche de microaguja (MNP) (n = 5 muestras biológicamente independientes). Las expresiones de ARNm alcanzan su punto máximo más tarde para las MNP en comparación con la suspensión de ARNm-LNP. (c) Expresión de FLuc después de 1 mes de almacenamiento a 37 °C en PVP:PVA 1:1 MNP mRNA-LNP. Se utilizó un ANOVA ordinario de dos vías (prueba de comparaciones múltiples de Sidak) (n = 5 muestras biológicamente independientes). (d) Inmunogenicidad de los parches de microagujas almacenados durante 1 mes (1 mes) o 3 meses (3 meses) utilizando un ensayo de electroquimioluminiscencia que mide la fuerza de las respuestas de unión al dominio de unión del receptor de la proteína S del SARS-CoV-2. Todos los ratones BALB/c fueron preparados con una dosis de 10 μg de ARNm de RBD del SARS-CoV-2 mediante inyección intramuscular (IM). En la semana 4, se aplicó una dosis de refuerzo que varió según el tiempo y las condiciones de almacenamiento, excepto en un grupo que no recibió ningún refuerzo para comparar. Se recogió suero a las 3 semanas (antes del refuerzo) y a las 9 semanas (después del refuerzo) (n = 5 muestras biológicamente independientes). Los datos representan la media ± sd NS, no significativo.

Notas complementarias 1 a 4 y tabla complementaria 1.

Película T1.

Película T2.

Película T3.

Película T4.

Película T5.

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Reimpresiones y permisos

vander Straeten, A., Sarmadi, M., Daristotle, JL et al. Una impresora de vacunas con microagujas para vacunas termoestables de ARNm COVID-19. Nat Biotechnol (2023). https://doi.org/10.1038/s41587-023-01774-z

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Recibido: 10 de enero de 2022

Aceptado: 30 de marzo de 2023

Publicado: 24 de abril de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41587-023-01774-z

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