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Jun 26, 2023

Píxel

Scientific Reports volumen 13, Número de artículo: 2934 (2023) Cite este artículo 943 Accesos 3 Detalles de Altmetric Metrics La interacción real entre especies de señalización en procesos celulares es a menudo

Scientific Reports volumen 13, número de artículo: 2934 (2023) Citar este artículo

943 Accesos

3 altmétrico

Detalles de métricas

La interacción real entre especies señalizadoras en los procesos celulares suele ser más importante que sus niveles de expresión. La transferencia de energía por resonancia de Förster (FRET) es una herramienta popular para estudiar interacciones moleculares, ya que es muy sensible a la proximidad en el rango de 2 a 10 nm. La FRET cuantitativa (3 cubos) con corrección de desbordamiento espectral es un enfoque rentable y versátil, que se puede aplicar en citometría de flujo y diversas modalidades de microscopía de fluorescencia, pero puede verse obstaculizado por diferentes niveles de autofluorescencia. Aquí, hemos implementado la corrección de autofluorescencia píxel por píxel en mediciones FRET de microscopía, explotando estándares de calibración sin células sin autofluorescencia que permiten la determinación correcta de todos los factores de desbordamiento espectral. También presentamos un complemento ImageJ/Fiji para el análisis interactivo de imágenes individuales, así como la creación automática de mapas cuantitativos de eficiencia FRET a partir de grandes conjuntos de imágenes. Para la validación, utilizamos modelos FRET basados ​​en cuentas y células que cubren un rango de relaciones de señal a autofluorescencia y eficiencias de FRET y comparamos el enfoque con la corrección de fondo/autofluorescencia promedio convencional. La corrección de autofluorescencia píxel por píxel demostró ser superior en la precisión de los resultados, particularmente para muestras con autofluorescencia que varía espacialmente y bajas proporciones de fluorescencia a autofluorescencia, siendo este último el caso a menudo para los niveles de expresión fisiológicos.

La transferencia de energía por resonancia de Förster (FRET) es una transferencia de energía no radiativa y no colisional entre un tinte donante fluorescente y un tinte aceptor espectralmente adecuado, que, para fines prácticos, a menudo se elige como fluorescente1. Desde finales de la década de 1960, FRET se ha convertido gradualmente en una herramienta popular para determinar la proximidad entre macromoléculas. La eficiencia de la transferencia de energía (E) es función de la sexta potencia inversa de la distancia entre los tintes donante y aceptor, que cambia rápidamente en el rango de 2 a 10 nm. Este rango de sensibilidad sirve como base para establecer y comparar interacciones a nivel molecular incluso en instrumentos ópticos que de otro modo están limitados a un menor poder de resolución debido a la difracción2. Incluso con las técnicas de superresolución que mejoran rápidamente y que hacen que el límite de resolución sea cada vez más bajo, ha quedado mucho espacio para las técnicas FRET3. Existe una amplia variedad de enfoques para medir FRET en microscopía4, desde mediciones de moléculas individuales5,6 hasta enfoques de conjunto, muchos de los cuales no requieren instrumentación costosa y/o no son destructivos para la muestra7,8,9. Estos abarcan métodos ratiométricos que se utilizan mejor en el campo en constante expansión de los biosensores basados ​​en proteínas fluorescentes con estequiometría donante/aceptor conocida10, así como modalidades de medición cuantitativa que producen una eficiencia FRET calibrada independiente de la estequiometría donante/aceptor11. De estos, la obtención de imágenes de vida útil de fluorescencia (FLIM) representa un método intrínsecamente cuantitativo pero requiere instrumentación avanzada12,13, mientras que FRET con corrección de desbordamiento espectral (o de tres cubos) es un enfoque rentable y versátil, que se puede aplicar en citometría de flujo y en técnicas convencionales. microscopio fluorescente. A diferencia de la también popular técnica de fotoblanqueo con aceptores14,15, también se puede utilizar junto con el análisis de imágenes en 3D y en lapso de tiempo11,16.

La principal limitación en todos los métodos para mediciones FRET es la relación señal-ruido (SNR). SNR es el valor esperado de la señal dividido por su SD. Aquí, el ruido de todas las intensidades de fluorescencia medidas utilizadas en cálculos posteriores se propaga a la eficiencia de FRET. Suponiendo una distribución Poissoniana de fotones detectados por píxel con valor esperado λ, si el ruido sistemático es insignificante, la SNR es √λ, por lo que se espera que intensidades más bajas aumenten en mayor medida la incertidumbre del FRET E determinado. Las muestras con SNR baja se pueden hacer más susceptibles al análisis FRET mejorando la eficiencia cuántica y la fotoestabilidad de los tintes fluorescentes, utilizando una detección más eficiente17, optimizando los pares de tintes FRET18,19 y mediante enfoques matemáticos y estadísticos mejorados20,21,22. 23. El uso del método con corrección de desbordamiento espectral generalmente permite concluir sobre las interacciones moleculares existentes cuando se observa una eficiencia FRET de ~ 5% o superior.

La SNR alcanzada también está limitada por la autofluorescencia celular. Dado que la autofluorescencia es menos pronunciada hacia la región espectral roja, preferiblemente se deben usar pares de tintes aceptores de donantes desplazados al rojo, como Alexa Fluor 546–Alexa Fluor 64724. También hay varios otros métodos disponibles para disminuir el efecto distorsionante de la autofluorescencia. El desbordamiento de la autofluorescencia en la fluorescencia de la etiqueta se corrigió tanto en microscopía25 como en citometría de flujo, lo que mejoró en gran medida la precisión de la determinación de FRET E26. El laboratorio de Silas Leavesley ha mejorado aún más el enfoque al introducir la separación espectral27 y demostró que el método es aplicable para evaluar mecanismos de señalización compartimentados utilizando imágenes espectrales 3D28. En un enfoque altamente innovador, Cardoso Dos Santos et al. han aplicado la sincronización del tiempo a la microscopía de imágenes de vida útil de la fluorescencia y han combinado puntos cuánticos con proteínas fluorescentes para evaluar FRET excluyendo la fluorescencia nativa29. Si bien las imágenes espectrales y de vida están ganando espacio, es al microscopio confocal convencional al que casi todos los biólogos tienen acceso hoy en día. Con esto en mente, nos hemos propuesto mejorar nuestro complemento ImageJ/Fiji anterior (RiFRET16) para evaluar mediciones FRET con corrección de desbordamiento espectral mediante la introducción de la opción de corrección de autofluorescencia píxel por píxel. Dado que la medición del factor de calibración del instrumento α se ve obstaculizada por diversas circunstancias incontrolables en los sistemas celulares y solo se ha logrado de manera confiable para construcciones de proteínas fluorescentes30,31, primero hemos creado y validado portaobjetos estándar sin células para su determinación precisa. Estos estándares también permitieron la determinación precisa de factores de desbordamiento espectral al obviar el efecto de confusión de la autofluorescencia celular. Finalmente, utilizando un conjunto de modelos con diferentes niveles de señales fluorescentes y autofluorescencia, hemos demostrado que la investigación de FRET en células con un nivel de expresión normal de las proteínas de interés y con niveles de autofluorescencia que varían espacialmente se beneficia más de la autofluorescencia píxel por píxel. corrección. El complemento RiFRET v2 ImageJ creado para un análisis fácil de usar de estas mediciones está disponible para la comunidad de investigación a través de GitHub, así como a través del actualizador de Fiji, y también permite el análisis completamente automático de grandes conjuntos de datos.

Para una medición FRET corregida píxel por píxel, se deben medir cuatro canales fluorescentes: I0 es la autofluorescencia medida en un canal auxiliar que, en nuestro ejemplo, está desplazado hacia el azul en comparación con el canal donante. También debería ser posible utilizar un canal rojo lejano para este propósito si el donante y el aceptor estuvieran más desplazados hacia el azul. En caso de que no fuera práctico utilizar excitación ultravioleta cercana y emisión azul (por ejemplo, en el caso de utilizar una tinción nuclear en este caso). dominio espectral). I1 es el canal donante, que debe ser espectralmente apropiado para el tinte donante. I2 es el canal de transferencia con excitación del donante y rango de detección del aceptor. I3 es el canal aceptor con excitación y detección adecuada para el colorante aceptor. Esta configuración espectral hace que el método sea adecuado para los pares FRET Alexa Fluor 488/546 y Alexa Fluor 546/647 u otros pares de tintes con propiedades espectrales similares. El primer paso de la evaluación es siempre la resta del fondo del instrumento para cada canal. Esto debe medirse en un portaobjetos no fluorescente.

Las ecuaciones (1 a 4) siguientes describen la contribución de varios componentes a cada canal de fluorescencia. AF es la autofluorescencia en el canal 0. ID e IA son la intensidad de fluorescencia del donante no apagado y del aceptor en sus propios canales de detección, respectivamente. Los otros componentes son factores de calibración que se describen a continuación.

El epsR (ecuación 5) es el producto de las relaciones entre los coeficientes de absorción molar del tinte donante y aceptor en las longitudes de onda de excitación de cada uno y sus coeficientes de absorción en sus propias longitudes de onda de excitación. Para la mayoría de los pares de tintes, este número es insignificante.

S1, S3 y S5 se determinan usando una muestra que contiene sólo el tinte donante como se describe en las Ecs. (6–8).

S2, S4 y S6 se determinan en una muestra de aceptor únicamente (ecuaciones 9 a 11).

B1, B2 y B3 se determinan en muestras celulares sin marcar (Nl) (ecuaciones 12 a 14).

El parámetro alfa corrige la diferencia en la eficiencia cuántica QA y QD y la eficiencia de detección ηA y ηD del donante y el aceptor, respectivamente, y se puede determinar en muestras marcadas con donante y aceptor (Ec. 15). Cuando se utilizan células marcadas para este fin, la relación entre los niveles de expresión de las moléculas donadoras y aceptoras debe ser constante en todas las células medidas. Idealmente, se utiliza el mismo epítopo, dirigido una vez con anticuerpos marcados con el donante y otra con el aceptor. \({I}_{2}^{D}\) y \({I}_{3}^{A}\) deben medirse en estas muestras y promediarse para al menos 5 a 10 imágenes. LD y LA, son el número medio de moléculas de tinte unidas al anticuerpo conjugado donante y aceptor, BD y BA son el número medio de receptores por célula marcadas por el anticuerpo conjugado donante y aceptor, y \({\varepsilon }_ {D}\) y \({\varepsilon }_{A}\) son los coeficientes de absorción molar de los tintes donante y aceptor en la longitud de onda de excitación del donante.

Alfa también se puede determinar utilizando portaobjetos estándar elaborados con los anticuerpos marcados, en cuyo caso BD y BA son la concentración molar de los anticuerpos conjugados del donante y del aceptor.

La eficiencia de FRET se calcula como

dónde

Utilizando este valor de eficiencia FRET, también se pueden calcular los valores reales de donante, aceptor y autofluorescencia:

Para calcular FRET sin corrección de autofluorescencia píxel por píxel, se pueden usar las mismas ecuaciones pero los factores S5, S6 y B asumen un valor de 0. Si no se realiza ninguna corrección de autofluorescencia, solo se resta el fondo del instrumento en cada imagen y canal. (Evaluación corregida por IGB). La opción clásica, sin embargo, es la corrección con autofluorescencia media (evaluación corregida AVG). Para este enfoque, la autofluorescencia promedio de los canales I1, I2 e I3 debe medirse en muestras sin etiquetar utilizando la misma configuración del instrumento. Estos valores (después de corregir el fondo del instrumento) se restan como constantes de los valores I respectivos en lugar de usar \(AF\cdot {B}_{1}\), \(AF\cdot {B}_{2}\) y \(AF\cdot {B}_{3}\) en las ecuaciones. (2–4). La ecuación (1) no se utiliza y el cálculo de la eficiencia FRET se simplifica a

Para probar el algoritmo de corrección de autofluorescencia, primero determinamos los espectros de autofluorescencia de las células A172 y SKBR3 tanto cuando están unidas a la superficie del vidrio como en suspensión. Los espectros de las líneas celulares muestran solo ligeras diferencias en la mayoría de los espectros visibles (Fig. 1a). El tratamiento con tripsina no cambió significativamente las propiedades de autofluorescencia (Figura complementaria 1a). La homogeneidad espectral de la autofluorescencia en las líneas celulares sugiere que es posible aplicar un canal de autofluorescencia auxiliar para la corrección de la señal de autofluorescencia píxel por píxel (PBP AF) en otros canales de fluorescencia, y este canal puede utilizar longitudes de onda de excitación y emisión. /rangos de longitud de onda que son claramente diferentes de los utilizados para el cálculo de FRET E. Esto representaría una mejora con respecto al enfoque anterior de citometría de flujo26, donde la excitación de los canales de autofluorescencia, donante y transferencia estaban en la misma longitud de onda. También hemos estudiado la distribución subcelular de la autofluorescencia (Fig. 1b), que mostró una alta falta de homogeneidad espacial en la intensidad de la emisión. A diferencia del alto coeficiente de variación y la distribución de intensidad bimodal en cada canal de fluorescencia, la distribución por píxeles de los factores de corrección de autofluorescencia, generada al dividir las imágenes del donante, del aceptor o de la transferencia por la imagen de referencia de autofluorescencia, era monomodal, casi gaussiana, y exhibía una coeficiente de variación inferior a la mitad de las imágenes originales (Figura complementaria 1b).

Caracterización de la autofluorescencia celular y diferentes métodos de corrección de la autofluorescencia. (a) Espectros de emisión de autofluorescencia de células A172 y SKBR-3 medidos con un detector espectral en 488; Excitación de 543 y 633 nm. Los canales de emisión típicos de una medición FRET se representan como bandas de colores. ( b ) Distribución de intensidad de autofluorescencia de una célula SKBR-3 y una A172. (c – e) Contribución de la autofluorescencia a los canales donante, de transferencia y aceptor de una medición FRET típica antes de la corrección, después de la corrección con autofluorescencia promedio y después de la corrección píxel por píxel, demostrada también utilizando células no marcadas cultivadas en un cubreobjetos. como células montadas en suspensión después de la tripsinización. Intensidades de emisión promedio de 6 muestras independientes en unidades arbitrarias como gráficos de violín (c canal donante, d canal de transferencia, e canal aceptor). (f) Relación de las desviaciones estándar de píxel por píxel corregidas con respecto a las distribuciones de autofluorescencia corregidas promedio de los datos en los paneles (c – e).

Para demostrar cuán efectivos son estos factores de corrección de FA en la corrección de PBP AF y qué ventajas puede tener su uso sobre la resta de autofluorescencia promedio, primero probamos y comparamos muestras no marcadas en los canales de fluorescencia que generalmente se usan en mediciones FRET de 3 cubos (Fig. 1c -F). La corrección de autofluorescencia perfecta en una muestra no marcada daría como resultado una intensidad media cero con una pequeña desviación estándar en cada canal. Como se esperaba, el promedio de intensidades celulares integradas fue cercano a 0 en el caso de ambas correcciones en los tres canales FRET (donante, transferente y aceptor, Fig. 1c-e, respectivamente), lo que indica que ambos métodos, en promedio, eliminan el fondo celular. pozo de fluorescencia. Sin embargo, los gráficos también revelan que el enfoque de corrección promedio produce una mayor dispersión de valores de fluorescencia corregidos célula por célula, por lo que, si bien en promedio esta corrección funciona bien, muchas células individuales no se corrigen adecuadamente. Esto se respalda calculando la relación de DE para PBP AF con respecto a la corrección promedio (Fig. 1f), que revela una mejora del 50 al 60 % en el caso de las células A172 y del 20 al 40 % en el caso de las células SKBR3, la diferencia siendo atribuible a los valores de autofluorescencia más bajos (y su menor divergencia absoluta) en este último. En conclusión, se puede decir que la corrección PBP AF proporciona los valores promedio correctos esperados al tiempo que mejora en gran medida la precisión de la determinación para cada celda individual, disminuyendo así la varianza del muestreo. A su vez, se espera que esto reduzca la varianza de los parámetros derivados, como FRET E, al reducir el error propagado hacia ellos desde múltiples imágenes. Se espera que a nivel subcelular se puedan lograr mejoras similares, como se demostrará más adelante utilizando muestras FRET biológicamente relevantes.

Sin embargo, antes de proceder a probar muestras etiquetadas, había que resolver un enigma de larga data. En un experimento FRET basado en intensidad, se deben determinar múltiples factores de corrección: factores de desbordamiento espectral (factores S, ecuaciones 6 a 11) y el factor de calibración alfa (ecuación 15). Cada factor de corrección debe determinarse en muestras etiquetadas individualmente. Debido a que las muestras celulares marcadas individualmente también tienen su propia autofluorescencia, que varía célula por célula y píxel por píxel, se desconoce la contribución relativa del desbordamiento espectral y la autofluorescencia a cualquier píxel, lo que impide la determinación correcta de las intensidades de fluorescencia. y por tanto, de S factores. Por lo tanto, hemos elaborado una receta para hacer portaobjetos de calibración sin células adecuados (consulte la sección "Materiales y métodos"). Estos portaobjetos se pueden almacenar durante al menos hasta 6 meses a 4 °C sin ningún signo de deterioro. En el panel izquierdo de la Fig. 2a, b, presentamos imágenes de ejemplo de esas muestras. Hemos probado el rendimiento de los portaobjetos para la determinación del factor S y alfa. Las intensidades promedio medidas se normalizaron a la concentración determinada fotométricamente del tinte fluorescente utilizado para cada portaobjetos (se muestran en la Tabla complementaria 1). Muestran una alta homogeneidad en varias muestras indicadas por desviaciones estándar bajas y una buena linealidad utilizando una amplia gama de potencias de excitación (Fig. 2a, b panel derecho; Fig. complementaria 2a). Los espectros de emisión de los tintes fluorescentes utilizados se midieron en muestras celulares y en portaobjetos estándar y fueron idénticos (Figura complementaria 2b). La estabilidad de los espectros y la linealidad de la emisión sugieren que los portaobjetos son adecuados para determinar los factores S y alfa. La confiabilidad de los portaobjetos estándar se probó adicionalmente en un experimento, donde se midieron 49 combinaciones de 14 portaobjetos estándar y se logró un CV del 12,5 % (Tabla complementaria 2). Como prueba adicional del concepto, el factor alfa se determinó con anticuerpos BIIG2 y ab528 tanto en células A172 marcadas como utilizando portaobjetos estándar de los anticuerpos marcados (Fig. 2c). El factor alfa determinado en portaobjetos estándar mostró diferencias menores entre los dos anticuerpos y un error de medición menor. También se debe considerar que los anticuerpos con diferentes proporciones colorante/proteína (DOL) pueden mostrar una afinidad de unión alterada, por lo que la DOL medida para la solución de anticuerpos y utilizada para determinar alfa puede no coincidir con la DOL promedio de los anticuerpos unidos a las células32. Este posible artefacto también se puede evitar utilizando portaobjetos estándar basados ​​en anticuerpos. En general, estos portaobjetos son un medio fácil y rentable para determinar los factores de corrección para las mediciones FRET, con el beneficio adicional de poder utilizar el anticuerpo más barato o más fácilmente disponible.

Portaobjetos estándar para determinar los factores de calibración del instrumento (α) y de desbordamiento espectral (S). (a,c) Imágenes de la película de trastuzumab conjugada Alexa Fluor 546 y 647 con distribuciones de intensidad en píxeles como recuadros. (b,d) Intensidades promedio de 3 anticuerpos diferentes conjugados con Alexa Fluor 546 o Alexa Fluor 647, representadas frente a potencias del láser de excitación de 543 nm, normalizadas a la concentración de tinte. Las barras de error representan ± SD de n = 5 imágenes (c) factor de calibración α determinado en células A172 y en portaobjetos estándar utilizando dos anticuerpos diferentes. Las barras de error son ± SD de n = 6 imágenes.

Para probar si y bajo qué condiciones la corrección PBP AF mejora las mediciones FRET en comparación con la corrección de autofluorescencia promedio, se construyó un sistema de prueba. En este sistema, se utilizó un anticuerpo primario no marcado y un marcaje secundario que mezclaba diferentes proporciones de anticuerpos secundarios conjugados donante y aceptor. De esta manera, se pueden construir complejos de proteínas con una eficiencia de FRET que oscila entre valores bajos y muy altos (Fig. 3a). Los anticuerpos primarios se unieron a perlas recubiertas de proteína G, células A172 o células SKBR3. Las perlas de proteína G tienen una alta densidad de sitios de unión de anticuerpos, además de una baja autofluorescencia, y pueden unirse tanto a los anticuerpos trastuzumab (humano) como a ab528 (de ratón). Las células SKBR3 expresan una gran cantidad de HER2 (~ 800.000 por célula, unidas por trastuzumab) y exhiben una autofluorescencia moderada. Las células A172 tienen una baja expresión de EGFR (~ 80.000 por célula, unidas por ab528) y la autofluorescencia más alta de todos los objetivos utilizados en esta configuración experimental. De esta manera, se pueden evaluar todas las combinaciones de FRET E alta y baja con autofluorescencia alta y baja e intensidades altas y bajas (Fig. 3b). Estas muestras se pueden medir tanto con un citómetro de flujo como con un microscopio, lo que permite comparar el rendimiento de los dos enfoques. Para realizar pruebas en pares FRET biológicamente relevantes, se utilizó la línea celular A172 que expresa EGFR e integrinas α5 (ITGA5) y β1 (ITGB1). Aquí, la interacción funcional de EGFR con cualquiera de las dos subunidades de integrina produce proporciones variables de aceptor/donante y valores variables de FRET E (Fig. 3c, d). Para el control positivo FRET, el anticuerpo primario conjugado del donante se marcó con el anticuerpo secundario apropiado conjugado con el tinte aceptor (Fig. 3d). Las proporciones de aceptor/donante fueron muy similares en las tres muestras de control positivo FRET (Figura complementaria 3).

Sistemas modelo para probar mediciones FRET corregidas por autofluorescencia píxel por píxel. ( a ) Esquemas de los complejos moleculares que cubren una amplia gama de proporciones de tinte aceptor a donante en los sistemas modelo FRET utilizados. ( b ) Cantidad relativa de complejos moleculares FRET (del panel a) en perlas recubiertas de proteínas y en células SKBR-3 y A172, y su relación con la intensidad de la autofluorescencia. (c) Niveles de expresión relativos de proteínas de la superficie celular en células A172. EGFR: receptor de EGF, ITGA5: integrina α5, ITGB1: integrina β1. Las barras de error representan ± SD, n = 6 imágenes, mínimo 30 celdas. ( d ) Esquemas de complejos moleculares biológicamente relevantes y las proporciones medidas de colorante aceptor a donante entre ellos.

Estas muestras FRET en perlas y células se midieron tanto con citometría de flujo como con microscopía. Los datos obtenidos se evaluaron con corrección de autofluorescencia tanto AVG como PBP. La eficiencia de FRET corregida por AVG se restó del valor corregido de PBP para cada célula o perla en cada muestra, y la media de la muestra y la DE de las diferencias se representaron frente a la proporción de anticuerpos secundarios conjugados con colorante aceptor y conjugados con colorante donante unidos a los objetivos primarios. La diferencia entre los métodos de corrección AVG y PBP fue insignificante, excepto para la muestra de alta autofluorescencia / baja intensidad (ab528 en células A172, Fig. 4a). Esto fue especialmente prominente en el caso de la medición basada en microscopio, donde la diferencia de eficiencias de FRET fue de alrededor de 0,1, con una tendencia fuertemente creciente en las proporciones más bajas de aceptor a donante (Fig. 4a, panel derecho). Al comparar los gráficos de FRET E real versus la proporción de aceptor a donante (Fig. 4b), las muestras basadas en células con un rendimiento de señal general bajo coinciden con las eficiencias de FRET en citometría de flujo y microscopía FRET corregida con PBP, y estas coinciden con PBP y AVG corregidas. Datos de microscopía FRET de muestras basadas en perlas de alta intensidad. Sólo los datos de microscopía celular de baja intensidad evaluados utilizando la corrección AVG divergen. Esta desviación de los valores reales supuestos probablemente se deba a la menor señal por píxel. Si bien el uso de la corrección AVG necesariamente corrige en exceso o en defecto cada píxel, este efecto perjudicial es más prominente en relaciones señal-ruido más bajas y el error aparentemente se propaga a la distribución de la eficiencia de FRET. El uso de la corrección PBP AF no mejora la SNR real, pero al menos elimina el error adicional introducido al corregir la autofluorescencia espacialmente desigual con una constante global, como se demuestra en la Fig. 1c, d. En general, las muestras más sensibles a la distorsión por la corrección AVG son aquellas con una baja relación entre señal de etiquetado y autofluorescencia, como se demuestra para cada canal de fluorescencia medido, tanto por citometría de flujo como por microscopía, en la Fig. 4c. En nuestro caso, las proporciones más bajas se midieron en ab528 anclado a EGFR, que une la mezcla de anticuerpos secundarios etiquetados con el donante y el aceptor, en células A172. En consecuencia, se esperaría que, en el caso de utilizar inmunofluorescencia directa para medir FRET entre EGFR y otras especies moleculares en la superficie de estas células, se produjera una desviación aún mayor de los valores reales cuando se utiliza la corrección AVG.

FRET medido en perlas y suspensiones celulares con microscopía y citometría de flujo. ( a ) Diferencias de la corrección de autofluorescencia promedio y píxel por píxel, medidas con citometría de flujo y microscopía confocal en el conjunto de muestras de control. Después de la selección, quedaron al menos 1700 celdas/5000 píxeles para cada punto trazado. Las barras de error son ± SD. (b) Eficiencias de FRET medidas con el donante en el anticuerpo ab528, representadas frente a la proporción de anticuerpo marcado con aceptor. (c) Señales de fluorescencia relativas a la autofluorescencia, medidas con citometría de flujo y microscopía en todos los canales relacionados con FRET. Los datos se muestran en gráficos de violín.

Por lo tanto, a continuación medimos la eficiencia de FRET entre EGFR e ITGA5 o ITGB1 en celdas A172. Dado que estas dos integrinas se expresan en una proporción de cinco y ocho veces con respecto al EGFR, respectivamente (Fig. 3c), medimos FRET una vez con el donante y luego con la etiqueta del aceptor en EGFR para evaluar la influencia de la proporción aceptor/donante. Para estas muestras, las eficiencias de FRET (Fig. 5a, panel izquierdo) siguieron las tendencias de las proporciones medidas de aceptor/donante (Fig. 3d), dando valores de FRET E más bajos para los casos en los que EGFR estaba marcado con el aceptor. Las eficiencias de FRET medidas entre EGFR e ITGA5 fueron generalmente bajas, con solo diferencias menores entre los valores no corregidos y los corregidos de PBP. La corrección AVG produjo un FRET E promedio negativo cuando ITGA5 era el donante, una fuerte indicación de que el método de corrección de autofluorescencia AVG puede producir artefactos fuertes, particularmente cuando FRET E es bajo. Las eficiencias de FRET medidas entre EGFR e ITGB1 fueron generalmente más altas, lo que indica que el posicionamiento estérico del anticuerpo que marca ITGB1 es más apropiado para el proceso FRET que el de ITGA5, aunque se espera que estas dos integrinas formen heterodímeros y, por lo tanto, podrían interactuar potencialmente con EGFR igualmente bien. La corrección AVG produjo una eficiencia FRET muy alta cuando ITGB1 era el aceptor y 0 cuando era el donante. Al mismo tiempo, la corrección de PBP produjo eficiencias FRET distintas de cero para ambas direcciones de transferencia de energía, siendo mayores los valores en proporciones más altas de aceptor a donante, como se esperaría de esta estequiometría. Esto subraya la inferioridad de la corrección de autofluorescencia AVG frente a la corrección PBP. De hecho, para las cuatro muestras, los valores de FRET E obtenidos con la corrección de autofluorescencia de PBP estaban en el rango medio, mientras que aquellos sin corrección o con corrección AVG estaban en los extremos, dependiendo de la relación señal/autofluorescencia (Fig. 5b). Cuando la relación señal/autofluorescencia era mayor en el canal donante, ninguna corrección dio los valores FRET más altos y la corrección AVG dio los más bajos y, a la inversa, para las muestras donde los valores de señal/autofluorescencia fueron mayores en el canal aceptor, la corrección AVG resultó en valores más altos y sin corrección en eficiencias FRET más bajas.

FRET medido con microscopía en células adherentes entre moléculas biológicamente relevantes y en controles positivos. Se midió FRET entre EGFR e ITGA5 o ITGB1 en ambas direcciones, así como entre anticuerpos primarios y secundarios unidos a cada una de estas dianas moleculares para controles positivos. (a) Eficiencias de FRET calculadas sin corrección de AF, corrección de AF promedio y corrección de AF píxel por píxel. Las barras de error son un intervalo de confianza de ± 95 % de 12 imágenes, cada una de las cuales contiene un mínimo de 5 celdas. (b) Señal de fluorescencia relativa a la autofluorescencia en los canales donante, de transferencia y aceptor, de las muestras en (a). Las medias de todas las imágenes de cada categoría se muestran como gráficos de violín.

También medimos y calculamos las eficiencias de FRET en muestras de control positivo (Fig. 5a panel derecho). La relación aceptor/donante medida fue idéntica para las tres muestras (Figura complementaria 3), lo que indica que las diferencias en las eficiencias de FRET no pueden explicarse por la estequiometría de los tintes. Las eficiencias de FRET corregidas por AVG siguieron las tendencias en los valores de señal/autofluorescencia en los canales FRET y aceptores, mientras que los valores no corregidos no siguieron una tendencia clara. La corrección de PBP produjo valores de FRET E independientes de las relaciones señal/autofluorescencia. En particular, dio como resultado eficiencias de FRET muy similares para los anticuerpos primarios monoclonales de ratón (anti-EGFR y anti-ITGB1) y una diferente para el anti-ITGA5, que es un anticuerpo monoclonal de rata. Suponiendo que los complejos de anticuerpos primarios marcados con el donante y secundarios marcados con el aceptor sean más similares cuando se utiliza la misma mezcla de anticuerpos secundarios, la diferencia entre los complejos FRET que contienen anticuerpos anti-rata y anti-ratón es aceptable. Al mismo tiempo, los valores casi idénticos para los dos anticuerpos secundarios anti-ratón indican claramente que la corrección de autofluorescencia de PBP es superior a la corrección de AVG y a la ausencia de corrección.

Para análisis adicionales, se utilizó la segunda muestra de anticuerpo EGFR →. En la Fig. 6a, se muestran dos regiones de interés (ROI), junto con sus histogramas FRET E; uno con alta y otro con baja autofluorescencia. También se muestran histogramas de todas las imágenes. Los histogramas corregidos por PBP muestran una distribución similar para las regiones AF baja y alta y para toda la imagen. Sin embargo, ninguna corrección produce distorsiones para el ROI de autofluorescencia alto, mientras que la corrección AVG genera anomalías similares a intensidades de autofluorescencia bajas. Para lograr una visión más cuantitativa, todos los píxeles de las muestras de control positivo basadas en EGFR y ITGB1 se agruparon y clasificaron en rangos de autofluorescencia alto, medio y bajo. Sus histogramas FRET E se pueden ver en la Fig. 4 complementaria. Los valores medios de los píxeles agrupados y sus intervalos de confianza del 95% obtenidos sin corrección, con AVG y con corrección PBP se muestran en la Fig. 6b. Las eficiencias de FRET calculadas sin corrección de AF son inversamente proporcionales a la autofluorescencia. Mientras que en la región de AF baja se superponen con el rango corregido de PBP, al aumentar la autofluorescencia se vuelven cada vez más subcorregidos. En el caso de la corrección AVG, los valores medios globales de las eficiencias de FRET están muy separados para las muestras de baja y alta intensidad y, en general, están sobrecorregidos. Sin embargo, con la corrección PBP, los promedios globales de las dos muestras de baja y alta intensidad son muy cercanos y no existe una influencia tendenciosa de la autofluorescencia en la eficiencia FRET calculada.

Efecto de la intensidad de la autofluorescencia sobre FRET calculado con diferentes métodos de corrección. ( a ) Imágenes de muestra de los 4 canales fluorescentes utilizados para las mediciones FRET (EGFR → 2º anticuerpo). ROI 1: baja autofluorescencia; ROI 2: alta autofluorescencia. La distribución por píxeles de FRET E para cada método de corrección se muestra para toda la imagen y para las regiones de interés AF bajas y altas. (b) Se agruparon píxeles de 12 imágenes cada uno de muestras preparadas con EGFR e ITGB1 (señal baja y alta, respectivamente) y se dividieron en autofluorescencia baja (-10–1.200), media (1.200–2.400) y alta (2.400–máx.). rangos. El FRET E promedio calculado con las tres opciones de corrección AF (barras de error que representan un intervalo de confianza de ± 95 %) se traza para cada rango y cada muestra. También se traza el promedio global para cada muestra y cada método de corrección (líneas discontinuas) con su intervalo de confianza del 95% mostrado como bandas del mismo color.

A pesar de los importantes avances en la medición precisa de la eficiencia de FRET en muestras autofluorescentes28, hasta ahora la comunidad de microscopía y biólogos no ha tenido a su disposición un método y un software relativamente sencillos para la corrección de la FA que pueda usarse con equipos generalmente disponibles. Aquí proporcionamos una solución de código abierto para la corrección de autofluorescencia píxel por píxel en mediciones FRET de microscopía y también describimos la preparación y validación de un nuevo portaobjetos estándar de calibraciones que permite la determinación unánime del desbordamiento espectral y los factores de calibración de instrumentos independientemente de la autofluorescencia celular. Basándonos en estos activos, demostramos, utilizando varios sistemas modelo, los beneficios de la corrección de autofluorescencia píxel por píxel.

En primer lugar, hemos utilizado una serie de mezclas de anticuerpos secundarios de proporciones variables de moléculas marcadas con aceptor y donante, que abarcan un rango de eficiencias de FRET de 0 al máximo, y las unimos a anticuerpos primarios en células y perlas. Descubrimos, utilizando mediciones de citometría de flujo como referencia, que a medida que la relación señal / autofluorescencia disminuía por debajo de ~ 100, la determinación microscópica de FRET E se volvió cada vez más inexacta sin la corrección AF píxel por píxel, independientemente de la eficiencia real de FRET. Dado que en los sistemas biológicos de interés la señal de autofluorescencia suele estar en este rango, a continuación investigamos dichos modelos, que presentan interacciones EGFR-integrinas patológicamente importantes33,34. Aquí hemos demostrado que la corrección AF píxel por píxel aumenta la precisión del cálculo FRET E y elimina el sesgo, que es inversamente proporcional a la relación señal/AF.

En general, llegamos a la conclusión de que el enfoque de corrección de autofluorescencia píxel por píxel se recomienda especialmente para casos de autofluorescencia celular altamente variable y para muestras con baja relación señal/autofluorescencia, que es típica de los niveles de expresión fisiológica. Con la llegada de los escáneres de patología de fluorescencia, el desafío de corregir la autofluorescencia espacialmente variada se vuelve cada vez más apremiante, dado que la FRET medida en secciones de tejido por tales dispositivos podría convertirse fácilmente, a largo plazo, en un enfoque diagnóstico33,35.

Todos los reactivos no especificados de otra manera se obtuvieron de Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU.

Trastuzumab (Herceptin®, Roche, se une a HER2); pertuzumab (Perjeta®, Roche, se une a HER2); Monoclonal de ratón TS2/16.2.1 producido internamente a partir de hibridoma (ATCC Cat# HB-243, se une a la integrina β1); Monoclonal de rata BIIG2 producido internamente a partir de hibridoma (ID de registro de anticuerpos DSHB: AB_528155, se une a la integrina α5); ab528 monoclonal de ratón producido internamente a partir de hibridoma (ATCC Cat# HB-8509 se une: receptor del factor de crecimiento epidérmico EGFR); IgG anti-ratón de cabra conjugada Alexa Fluor 546 (H + L), altamente adsorbida de forma cruzada (ThermoFisher cat# A- 11030); Alexa Fluor 647 conjugado con IgG de cabra anti-ratón (H + L) altamente adsorbido de forma cruzada (ThermoFisher cat# A-21235); Alexa Fluor 546 conjugado con IgG antihumana de cabra (H + L) altamente adsorbido de forma cruzada (ThermoFisher cat# A-21089); IgG antihumana de cabra conjugada Alexa Fluor 647 (H + L) con alta adsorción cruzada (ThermoFisher cat# A-21445); IgG anti-rata de cabra conjugada Alexa Fluor 647 (H + L) con alta adsorción cruzada (ThermoFisher cat# A-21445); -21247).

Los anticuerpos monoclonales (trastuzumab; pertuzumab; ab528; TS2) se marcaron con éster succinimidílico Alexa Fluor 546 o Alexa Fluor 647 (ThermoFisher Cat# A20002 y A20006) de acuerdo con las recomendaciones del fabricante, luego se purificaron en una columna Sephadex G50 (Cat# 9048-71- 9). El contenido de proteína y colorante resultante se midió con un espectrofotómetro NanoDrop ND-1000. Se diluyeron 5 µl de solución de anticuerpo conjugado en 45 µl de disolvente que comprendía BSA al 0,3 m/m% (VWR Chemicals n.º de catálogo 0332-100G) y Mowiol antifade al 70% que comprendía TrisHCl 0,1 M, pH 8,5, glicerol al 25% (p/v). y 10% Mowiol 4-88, Polysciences, Warrington, PA, EE. UU. en PBS. Se pipetearon 30 µl de este anticuerpo diluido sobre un portaobjetos y se cubrieron con cubreobjetos de vidrio redondos de 12 mm de diámetro (0,17 mm de espesor) limpiados con acetona. Las muestras se secaron durante la noche a temperatura ambiente y luego se almacenaron a 4 °C. Para determinar el fondo del instrumento, se preparó un portaobjetos no fluorescente reemplazando los 5 µl de conjugado de anticuerpo con el mismo volumen de BSA al 1 m/m% en PBS.

Se cultivaron células de glioblastoma A172 (ATCC Cat# CRL-1620) y cáncer de mama SKBR3 (ATCC Cat# HTB-30) en DMEM suplementado con 10% de FBS, a 37 °C con 5% de CO2 en una incubadora humidificada durante 2 días en T75. matraces de cultivo celular o en cubreobjetos de vidrio redondos esterilizados de 12 mm de diámetro (0,17 mm de espesor).

Las células cultivadas en un matraz T75 se enjuagaron con 5 ml de tampón HEPES suplementado con glucosa 4 mM, luego se trataron con 0,5 g/dm3 de tripsina (n.º de catálogo 27250018) y 0,2 g/dm3 de EDTA (n.º de catálogo 15576028) en 1 ml de PBS filtrado de forma estéril. durante 5 min a 37°C. Las células desprendidas se recogieron y se lavaron durante 5 minutos a 4 °C en tampón HEPES suplementado con glucosa 4 mM a 200 g en un tubo estándar de 15 ml. Se eliminó el sobrenadante, el sedimento se resuspendió y se fijó en 1 ml de formaldehído al 1% en tampón HEPES durante 15 minutos a temperatura ambiente. Las células se lavaron nuevamente durante 5 minutos en tampón HEPES a temperatura ambiente. Las células A172 y SKBR3 se marcaron durante 30 minutos a temperatura ambiente con una concentración final de 20 µg/ml de ab528 y trastuzumab, respectivamente, luego se lavaron con tampón HEPES suplementado con glucosa 4 mM y se centrifugaron a 200 g. Para el marcaje fluorescente secundario, las células A172 se marcaron con diferentes proporciones de anticuerpos anti-ratón de cabra conjugados con Alexa Fluor 546 o Alexa Fluor 647 a una concentración total de 10 µg/ml. Las células SKBR3 se marcaron de la misma manera, excepto que se utilizaron anticuerpos antihumanos de cabra. Después de 30 minutos de incubación a temperatura ambiente, las células se lavaron como se describió anteriormente y los sedimentos se resuspendieron en 150 µl de tampón HEPES que contenía formaldehído al 1%. Los controles no etiquetados se realizaron utilizando el mismo protocolo pero omitiendo los anticuerpos.

El marcaje de las perlas recubiertas de proteína G (Bangslabs Protein G Antibody Binding Beads cat# 554) siguió un protocolo similar pero sin aplicar el primer paso de fijación. Las concentraciones de anticuerpos primarios fueron 100 µg/ml para lograr la concentración de saturación (Figura complementaria 5).

Se mezclaron 20 µl de cada muestra (células y perlas) con 20 µl de Mowiol antifade. Se pipetearon 30 µl de esta mezcla sobre un portaobjetos de vidrio Superfrost y se cubrieron con cubreobjetos de vidrio redondos de 12 mm de diámetro (0,17 mm de espesor) limpiados con acetona. Los portaobjetos se secaron durante la noche a temperatura ambiente y se almacenaron a 4 °C.

Se tomaron imágenes de los portaobjetos con un microscopio de barrido láser Zeiss LSM 880. Las suspensiones de muestras restantes sin montar se midieron con un citómetro de flujo ACEA NovoCyte RYB.

Las células A172 cultivadas en cubreobjetos de vidrio redondos de 12 mm de diámetro se retiraron del medio y se colocaron sobre una superficie metálica recubierta de parafilm enfriada con hielo y se lavaron con tampón HEPES suplementado con glucosa 4 mM. Las células se fijaron durante 15 min a 4 °C con formaldehído al 1% en tampón HEPES, luego se lavaron 3 veces con tampón HEPES (durante 2, 3 y 7 min) a temperatura ambiente. Todos los pasos consecutivos se realizaron a temperatura ambiente. Para el etiquetado directo, las células se marcaron con anticuerpos marcados con donante y aceptor, cada uno a una concentración final de 20 µg/ml en tampón HEPES que contenía BSA al 2 % durante 30 minutos, utilizando las siguientes combinaciones: ab528-Alexa Fluor 546 + BIIG2-Alexa Fluor 647; ab528-Alexa Flúor 647 + BIIG2-Alexa Flúor 546; ab528-Alexa Flúor 546 + TS2-Alexa Flúor 647; ab528-Alexa Fluor 647 + TS2-Alexa Fluor 546. Para el marcaje indirecto, se utilizaron los anticuerpos primarios ab528-Alexa Fluor 546, BIIG2-Alexa Fluor 546 y TS2-Alexa Fluor 546 de la misma manera, a una concentración final de 20 µg/ml. Después de este paso de etiquetado, las células se lavaron nuevamente 3 veces (durante 2, 3 y 7 minutos) con tampón HEPES. En el caso del marcaje indirecto, esto fue seguido por un ciclo de marcaje similar usando 10 µg/ml de anticuerpos secundarios conjugados Alexa Fluor 647 adecuados para el anticuerpo cebador diluidos en HEPES que contenía BSA al 2 % durante 30 minutos. Al lavado final le siguió la fijación en formaldehído al 1% en tampón HEPES durante 15 minutos y el montaje en portaobjetos de vidrio Superfrost con Mowiol. También se prepararon controles individuales etiquetados y no etiquetados para determinar los factores de corrección y los espectros de emisión.

Todas las imágenes se realizaron con un microscopio de barrido láser confocal (LSM 880, Carl Zeiss GmbH, Jena, Alemania), utilizando un objetivo de inmersión en agua apocromático C de 40 × (NA = 1,2, número de artículo: 421767-9971). Los poros se configuraron con un grosor de corte de 1 µm y el tamaño de píxel en 100 nm (muestreo óptimo basado en Nyquist). Para resolver espectralmente la autofluorescencia, la emisión de células no teñidas se resolvió en una matriz de GaAsP de 32 elementos del microscopio con un tamaño de paso de 8,92 nm, utilizando excitación secuencial de 488, 543 y 633 nm. Se empleó la misma estrategia de adquisición de datos para verificar la estabilidad espectral de la emisión del donante y del aceptor en portaobjetos estándar y células marcadas.

Para las mediciones FRET, el microscopio estaba funcionando en modo de escaneo de línea y todos los canales fluorescentes fueron detectados por el detector GaAsP de 32 canales del instrumento. En el canal de autofluorescencia, la excitación fue de 488 nm y el rango de detección fue de 499 a 535 nm. Los canales donante y de transferencia se excitaron simultáneamente con una excitación de 543 nm y se detectaron entre 553–615 nm y 651–695 nm, respectivamente. El canal aceptor se excitó a 633 nm y se detectó en el rango de 651 a 695 nm.

Las mediciones de fluorescencia por citometría de flujo y FRET se realizaron con un citómetro NovoCyte RYB. Para la autofluorescencia, se utilizó el canal FITC-H predefinido del instrumento (excitación de 488 nm y detección de 515 a 545 nm); el canal donante fue PE-H (excitación de 561 nm y detección de 576–596 nm); el canal de transferencia fue PE-Cy5 mPlum-H (excitación de 561 nm y detección de 650–670 nm); y el canal aceptor APC-H (excitación de 640 nm y detección de 650 a 670 nm). Para la evaluación, la determinación del factor de activación y corrección se realizó en FCS Express v7. Las muestras FRET controladas se exportaron a CSV, las fórmulas de cálculo FRET (ver ecuaciones) se aplicaron en MS Excel y luego los datos del modo de lista FRET recién creados se importaron a FCS Express para su visualización.

Todo el análisis de imágenes se realizó utilizando Fiji (https://fiji.sc/)36. Un complemento creado previamente en nuestro laboratorio para calcular FRET cuantitativo (3 filtros) con corrección de desbordamiento espectral convencional (RiFRET16) se ha reescrito para incluir la corrección de autofluorescencia píxel por píxel, así como para ofrecer un procesamiento completamente automático de imágenes más grandes. conjuntos de imágenes y ser compatible con ImageJ 2.0. El código fuente está disponible en GitHub (https://github.com/CellMoTher/RiFRET) y el complemento está disponible a través del sitio de actualización "FRET Imaging" en Fiji.

Los conjuntos de datos generados y analizados en este estudio están disponibles del autor correspondiente previa solicitud razonable. No se han generado datos pertinentes a bases de datos públicas.

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Departamento de Biofísica y Biología Celular, Facultad de Medicina, Universidad de Debrecen, Egyetem tér 1, Debrecen, 4032, Hungría

István Rebenku, Cameron B. Lloyd, János Szöllősi y György Vereb

ELKH-DE Grupo de Investigación en Biología Celular y Señalización, Facultad de Medicina, Universidad de Debrecen, Egyetem tér 1, Debrecen, 4032, Hungría

István Rebenku, János Szöllősi y György Vereb

Facultad de Farmacia, Universidad de Debrecen, Egyetem tér 1, Debrecen, 4032, Hungría

george gorrión

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Correspondencia a György Vereb.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Rebenku, I., Lloyd, CB, Szöllősi, J. et al. FRET con corrección de autofluorescencia píxel por píxel en microscopía de fluorescencia mejora la precisión de las muestras con una relación de señal y autofluorescencia espacialmente variada. Informe científico 13, 2934 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-30098-w

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Recibido: 23 de agosto de 2022

Aceptado: 14 de febrero de 2023

Publicado: 20 de febrero de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-30098-w

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