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Dec 01, 2023

La microbiota intestinal se vincula con la estabilidad del aloinjerto después del trasplante de pulmón: un estudio de cohorte prospectivo

Transducción de señales y terapia dirigida volumen 8, número de artículo: 326 (2023) Citar este artículo Detalles de las métricas Si la microbiota alternada en el intestino contribuye al riesgo de aloinjerto

Transducción de señales y terapia dirigida volumen 8, número de artículo: 326 (2023) Citar este artículo

Detalles de métricas

Aún no se ha explorado si la microbiota alternada en el intestino contribuye al riesgo de rechazo de aloinjerto (RA) e infección pulmonar (PI) en el contexto de los receptores de trasplantes de pulmón (LTR). Se identificó una cohorte multicéntrica prospectiva de LTR en los cuatro centros de trasplante de pulmón. Se recogieron muestras pareadas de heces y suero y se dividieron en grupos AR, PI y libre de eventos (EF) según el diagnóstico en el momento del muestreo. Las muestras fecales se determinaron mediante secuenciación metagenómica. Y se detectaron metabolitos y citocinas en el suero emparejado para analizar el efecto potencial de la comunidad de microbiota alterada. En total, analizamos 146 muestras pareadas (AR = 25, PI = 43 y EF = 78). En particular, encontramos que el microbioma intestinal de AR siguió un patrón de agotamiento importante con una disminución de 487 especies y diversidad composicional. Un análisis multiómico adicional mostró una disminución de los metabolitos séricos y un aumento de las citoquinas inflamatorias en AR y PI. Bacteroides uniformis, que disminuyó en AR (2,4 % frente a 0,6 %) y se asoció negativamente con la IL-1β e IL-12 séricas, se identificó como una especie impulsada en la red del microbioma intestinal de EF. Funcionalmente, las muestras de EF abundaban en probióticos relacionados con el metabolismo de la manosa y los péptidos antimicrobianos catiónicos. Además, un clasificador de máquina de vectores de soporte basado en microbioma, metaboloma y parámetros clínicos predijo altamente AR (AUPRC = 0,801) y PI (AUPRC = 0,855), por lo que el conjunto de datos del microbioma mostró un poder de diagnóstico particularmente alto. En conclusión, una microbiota intestinal disruptiva mostró una asociación significativa con el rechazo y la infección del aloinjerto y con las citoquinas y metabolitos sistémicos en las LTR.

El trasplante de pulmón es una terapia potencialmente curativa para pacientes con enfermedad pulmonar terminal.1 Sin embargo, la supervivencia general después de un trasplante de pulmón sigue siendo inferior en comparación con otras modalidades de trasplante de órganos sólidos.2,3 Para los receptores adultos de trasplante de pulmón (LTR) que sobrevivieron 1 año después del trasplante, la mediana de supervivencia aumenta de 6,7 a 8,9 años. El rechazo grave del aloinjerto (RA) y la infección pulmonar (IP) son las complicaciones más comunes dentro del año posterior al trasplante.4 Estas enfermedades no solo son las principales causas de muerte, sino que también están asociadas con la disfunción crónica del injerto pulmonar (CLAD).5 Inflamatoria Los eventos del aloinjerto, como la disfunción primaria del injerto, se asocian con el desarrollo posterior de AR e IP.6,7,8 Sin embargo, las predisposiciones a la susceptibilidad al rechazo pulmonar y a la infección no se comprenden completamente.2

Estudios longitudinales previos basados ​​en secuenciación de genes han revelado que el microbioma es apreciable en sujetos sanos, está alterado en enfermedades patológicas y está significativamente asociado con resultados clínicos.9,10 La diversidad microbiana intestinal reducida se correlaciona con la etiología y la gravedad de la enfermedad del aloinjerto.11,12 Evidencias convincentes también han demostrado que el microbioma intestinal podría modular la aloinmunidad y el rechazo, lo que implica directamente al microbioma intestinal como objetivo terapéutico en el trasplante de órganos.13,14 Además, estudios longitudinales de pacientes sometidos a trasplantes de hígado y riñón han demostrado una alteración del microbioma intestinal. después del trasplante se caracterizó por la pérdida de diversidad con importantes vías metabólicas y la dominación de una sola especie, y un aumento en la prevalencia de genes de resistencia a los antibióticos.12 Estos resultados respaldaron que posibles intervenciones dirigidas al microbioma intestinal podrían influir en la supervivencia de los pacientes que recibieron órganos sólidos. trasplante.

Se ha informado ampliamente sobre la posibilidad de que la microbiota del tracto respiratorio inferior pueda tener efectos locales después del trasplante de pulmón.15,16,17 Según estos estudios, una mayor carga bacteriana del tracto respiratorio inferior y una menor diversidad se asocian con un aumento de la AR y una supervivencia inferior. Mientras tanto, las bacterias asociadas al intestino se enriquecieron significativamente en los pacientes con inflamación pulmonar. Más importante aún, estudios recientes han demostrado que la microbiota intestinal es vital para determinar enfermedades respiratorias, como el asma y el desarrollo de atopia.18 Curiosamente, Wu et al. indicaron que las funciones mediadoras inmunitarias directas de la microbiota intestinal en modelos de ratones AR se producen mediante la alteración de las respuestas Th17.19 Hasta la fecha, se desconoce si el microbioma intestinal puede vincularse con enfermedades de aloinjertos en el contexto de un trasplante de pulmón.

Nuestra hipótesis es que la microbiota intestinal está asociada con trastornos pulmonares, incluidos AR e IP, dentro del año posterior al trasplante. Se inició un estudio de cohorte prospectivo multicéntrico de LTR sometidos a broncoscopia de vigilancia por protocolo. Se evaluó la asociación entre la composición de la comunidad de microbiota en heces con el desarrollo de enfermedades pulmonares. Posteriormente, se examinaron los metabolitos y citocinas de la sangre periférica emparejada para tener en cuenta las diferencias microbianas. Finalmente, diagnosticamos con precisión AR y PI a partir de nuestros datos multiómicos utilizando un enfoque de aprendizaje automático.

Este estudio prospectivo multicéntrico involucró a 82 LTR que se sometieron a un trasplante de pulmón entre mayo de 2020 y diciembre de 2022 y proporcionó las características demográficas en la Tabla complementaria 1. Más de la mitad de los diagnósticos previos al trasplante fueron enfermedad pulmonar intersticial (51,2%). Además, se analizaron 146 pares de heces y muestras de suero periférico después del control de calidad (Fig. 1a). Estas muestras se clasificaron en tres grupos según el diagnóstico en el momento del muestreo (Figura 1 complementaria). AR, PI y libre de eventos (EF) representaron 25 (17,1%), 43 (29,5%) y 78 (53,4%) casos en el estudio, respectivamente. Los puntos temporales para cada muestra fueron similares para los tres grupos. En contraste con las características demográficas y los recuentos sanguíneos (Tabla complementaria 2), se observaron resultados de cultivos y antibióticos más positivos en el grupo de PI.

a Descripción general del diseño del estudio. La ilustración fue creada con BioRender.com. b Abundancias relativas (%) de los filos más abundantes en todas las muestras fecales. Los diagramas de caja muestran la mediana (línea media), los percentiles 25 y 75 (caja) y los percentiles 5 y 95 (bigotes), así como valores atípicos (puntos únicos). c Prevalencia (% de muestras) del género entre muestras para los cuatro filos más abundantes. La coordenada Y representa la prevalencia del género en todas las muestras y la coordenada X representa la abundancia relativa máxima del género en una sola muestra. El color de los puntos muestra diferentes géneros y el tamaño muestra lecturas enrarecidas totales

Firmicutes y Bacteroidetes, seguidos de Proteobacteria y Actinobacteria, fueron los filos más abundantes en las LTR, en consonancia con cohortes anteriores de individuos sanos (Fig. 1b y Tabla complementaria 3). Y ≥75% de las muestras compartieron 32 géneros entre los cuatro filos más abundantes (Fig. 1c). La prevalencia de Bacteroidetes phyla disminuyó significativamente en AR, en comparación con EF (p = 0,043, figura complementaria 2). Los gráficos de puntuación del Análisis de Coordenadas Principales (PCoA) a nivel de especie mostraron una alteración detectable en la estructura general de los microbiomas intestinales de AR/PI en comparación con EF. (Fig. 2a, b, prueba de Permanova basada en distancias de Bray-Curtis, AR vs EF, p = 0,004; PI vs EF, p = 0,046). Además, se observó un agotamiento significativo de genes microbianos en los individuos con AR y PI (PCoA1, índice de Shannon, índice de Pielou y número de especie, Fig. 2c-e).

a Análisis de coordenadas principales (PCoA) de especies en tres grupos. Se utilizó PERMANOVA para definir diferencias significativas entre el rechazo de aloinjerto (AR), la infección pulmonar (PI) y la ausencia de eventos (EF). b – e Las coordenadas más principales, el índice de Shannon, el índice de Pielou y el número de especies de microbiotas intestinales en AR, PI y EF. La línea central del cuadro representa la mediana y los límites del cuadro representan el rango intercuartil. Los bigotes abarcan 1,5 veces el rango intercuartil. La comparación entre los grupos se probó mediante la prueba bilateral de Kruskal-Wallis, **p < 0,01 y ***p < 0,001. f Las especies significativamente diferenciales en f AR vs EF y g PI vs EF. Las especies significativamente diferenciales se definieron por una tasa de descubrimiento falso inferior a 0,1 en la prueba de suma de rangos de Wilcox y un cambio entre dos grupos superior a 2. Los puntos rojo, amarillo y verde representan AR, PI y EF, respectivamente.

En total, se agotaron 487 especies y 16 se enriquecieron en las muestras AR en comparación con EF (Fig. 2f y Tabla complementaria 4, Tasa de descubrimiento falso (FDR) <0,1 y cambio >2 veces (FC)). Estos resultados son similares a los hallazgos informados anteriormente, como un agotamiento relativo de las bacterias probióticas (como Bacteroides uniformis, Lachnospiraceae, Blautia obeum y Phascolarctobacterium succinatutens) y un enriquecimiento de Enterococcus phage_IME_EFm1 y Desulfovibrio sp_An276 en pacientes con inflamación pulmonar. En estas especies, las familias de bacterias de Bacteroides y Lachnospiraceae son productoras conocidas de ácidos grasos de cadena corta (particularmente butirato), que desempeñan funciones cruciales en el aumento de la inmunidad del huésped.20,21 Además, tres especies se enriquecieron significativamente y 18 disminuyeron en el IP. muestras (Fig. 2g y Tabla complementaria 5). Sin embargo, las diferencias entre los grupos AR y PI no se observaron a nivel de especie (Figura complementaria 3). A continuación, combinamos las muestras de AR y PI en un grupo con trastorno de aloinjerto. Las especies compartidas por más del 50% de los sujetos en el grupo con trastorno de aloinjerto o EF se utilizaron para construir una red de coabundancia microbiana. El grupo con trastorno del aloinjerto y EF difirieron significativamente en las características de la red microbiana intestinal. Observablemente, la microbiota intestinal del grupo EF formó una comunidad más sólida (Fig. 3a, b). Se observaron menos números de bordes, números de nodos, conectividad neta y vulnerabilidad neta en la red de muestras de trastornos de aloinjertos que en EF, lo que indica una mayor conectividad de red en las LTR de EF (Tabla complementaria 6). Preguntamos si alguna especie clave impulsa las diferencias entre las redes en función de los parámetros de grado promedio, centralidad de cercanía y centralidad de intermediación. Identificamos una especie bacteriana de la familia Bacteroides, indexada uniformis, que enriqueció EF (abundancia relativa = 2,4%) y redujo significativamente en AR (abundancia relativa = 0,6%, FDR = 0,04). Se informó como un probiótico inmunomodulador, que optimiza el equilibrio sistémico Th1/Th2 para reducir los trastornos autoinmunes en modelos experimentales.22 Además, el análisis de Netshift reveló que Bacteroides uniformis tenía un núcleo de desplazamiento vecino (NESH) más alto (1,125) y una mayor intermediación entre 39 especies impulsadas (Tabla complementaria 7). Este hallazgo respalda que Bacteroides uniformis es la principal especie impulsora del cambio en la comunidad microbiana.

La red de asociación microbiana para un trastorno de aloinjerto y muestras de b EF. La correlación de coabundancia entre las especies se calculó utilizando la correlación SparCC. Se incluyeron todas las correlaciones significativas con p < 0,05 ajustado por BH. Cada nodo representa una especie microbiana. Los bordes entre nodos representan correlaciones. c Los módulos modificados significativamente de la Enciclopedia de genes y genomas de Kyoto (KEGG) en AR vs EF y PI vs EF. Los módulos significativamente diferenciales se definieron por una tasa de descubrimiento falso inferior a 0,1 en la prueba de suma de rangos de Wilcox y un cambio entre dos grupos superior a 2. d FFA antibacteriano y genes relacionados con la mupirocina en la microbiota intestinal de tres grupos. La línea central del cuadro representa la mediana y los límites del cuadro representan el rango intercuartil. Los bigotes abarcan 1,5 veces el rango intercuartil. La comparación entre los grupos se probó mediante la prueba de Kruskal-Wallis. **p<0,01

Investigamos más a fondo la función del microbioma intestinal alterado. El análisis basado en módulos de la Enciclopedia de genes y genomas de Kyoto (KEGG) mostró que la biosíntesis de manosa, la N-glicosilación por oligosacariltransferasa y el metabolismo del metano se alteraron significativamente en las muestras de AR (Fig. 3c y Tabla complementaria 8). La suplementación con manosa suprimió directamente la producción de TNF-α de los macrófagos al reducir el nivel de gliceraldehído 3-fosfato en el intestino. Además, se observó un aumento del metabolismo del fosfato de inositol y de la biosíntesis de ergocalciferol en las muestras de PI (Tabla complementaria 9). El análisis de correlación mostró que la reducción del metabolismo se asociaba positivamente con una menor cantidad de probióticos (Tabla complementaria 10). Además, un análisis de genes de resistencia a antibióticos mostró que se observaron más ácidos grasos libres de antibacterianos y especies relacionadas con mupirocina en las muestras de EF (Fig. 3d, e). Nuestros datos revelaron que el metabolismo disfuncional de los oligómeros en la funcionalidad del microbioma intestinal se debe a la disminución de los probióticos.

Basándonos en la observación de que la microbiota intestinal está significativamente alterada en AR y PI, planteamos la hipótesis de que estos cambios de composición desempeñan un papel en la exacerbación de la enfermedad al contribuir a la desregulación de la respuesta inmune. Para investigar las alteraciones en los perfiles inmunológicos después del trasplante de pulmón, se compararon los niveles séricos de 27 citocinas, incluidas siete categorías funcionales, en los tres grupos. Las citoquinas detectadas participan en la remodelación de tejidos, la inmunorregulación, la inflamación, etc. Sus patrones diferían significativamente entre los tres grupos (Fig. 4a y Tabla complementaria 11). Los pacientes con AR y PI mostraron un estrés inflamatorio significativo con 12 citocinas, como IL-6, IL-12, IL-17 y TNF-α, significativamente reguladas al alza. Posteriormente, encontramos que la microbiota intestinal se asoció significativamente con las citocinas reguladas al alza en el análisis de correlación. La IL-6 sérica, identificada como un factor clave en el rechazo del injerto, se correlacionó positivamente con un aumento de Enterococcus spp. y Lactococcus spp. en pacientes con AR (Fig. 4b y Tabla complementaria 12). Además, la reducción de 16 especies de Bacteroides y 7 de Clostridium se correlacionó negativamente con la IL-6. Curiosamente, encontramos que 3 especies de fagos de Enterococcus, que estaban enriquecidas en EF y que, según se informó, reducen las bacterias patógenas con un daño mínimo a la flora normal, se asociaron negativamente con varias citoquinas inflamatorias (MIP-1β, IL-1α, TNFα e IL-17). ). Además, Bacteroides uniformis se asoció negativamente con IL-1β e IL-12, lo que indicó que el microbioma intestinal está involucrado en enfermedades de aloinjertos, posiblemente mediante la modulación de las respuestas inmunes del huésped en el trasplante de pulmón.24,25

Un gráfico de radar muestra la expresión mediana de log10 de 27 citocinas en el suero en tres grupos. La distribución circular de las citoquinas está codificada por colores mediante siete categorías funcionales y las garrapatas muestran un aumento en la expresión desde el interior hacia el exterior del círculo. b La correlación del microbioma fecal seleccionado con las citocinas séricas. Especies con enriquecimiento en muestras AR, PI o EF indicadas por la barra de color en la parte superior del mapa de calor. Las estrellas negras dentro de los cuadros del mapa de calor indican resultados significativos. *p<0,05

A continuación, preguntamos qué factores ambientales explican los niveles del microbioma intestinal alterado. Se sabe que los metabolitos séricos desempeñan un papel clave en la mediación de las interacciones metabólicas e inmunes entre el microbioma y su huésped, proporcionando así una visión fundamental de la compleja dinámica de las exposiciones ambientales. De acuerdo con el microbioma intestinal, los individuos con AR exhibieron un amplio conjunto de perturbaciones con un patrón de agotamiento importante en los niveles de metabolitos séricos. Se identificaron cincuenta y dos metabolitos alterados entre los tres grupos (Fig. 5a y Tablas complementarias 13 y 14). Anteriormente se informó que varios metabolitos agotados, como la glucosa-6-fosfato, atenúan la lesión pulmonar.26 Además, se analizó la correlación entre las especies microbianas intestinales significativamente modificadas y los metabolitos séricos. Descubrimos que la reducción de lípidos (ácido (S) -abscísico, jasmonato de metilo y cortisol) se correlacionaba positivamente con esta disminución de probióticos (Fig. 5b y Tabla complementaria 15). Estas especies se derivan principalmente de Bacteroidetes (28 especies) y Clostridium (20 especies). De estos, el ácido (S)-abscísico, que se informó que reduce la lesión pulmonar a través de la señalización del receptor γ activado por el proliferador de peroxisomas (PPAR-γ), está fuertemente asociado con la eliminación de 86 especies.27 Además, la pérdida de Bacteroides uniformis es significativa. asociado con un aumento del ácido quinolínico, que es una neurotoxina bien conocida. Estos resultados sugieren que los probióticos intestinales desempeñan un papel protector potencial en el desarrollo de la RA, mediado por una serie de metabolitos sanguíneos circulantes, varios de los cuales previamente se demostró que desempeñan un papel central en la inflamación pulmonar, mientras que otros no fueron informados. Por lo tanto, tras una mayor validación en estudios experimentales, estos metabolitos pueden formar nuevos objetivos para atenuar el riesgo de enfermedad.

a Los 52 metabolitos alterados significativos entre AR, PI y EF. La comparación entre dos grupos se probó mediante la prueba t de Student. b La correlación del microbioma fecal seleccionado con los metabolitos séricos. Las especies y metabolitos significativamente correlacionados (calculados mediante correlación de Spearman, p < 0,01) se muestran en el ciclo. Las especies y metabolitos enriquecidos en muestras AR, PI o EF se indican mediante la barra de color de la pista interior. El filo del microbioma y los metabolitos de clase se indican mediante la barra de color fuera de la pista. Las líneas verde y amarilla representan una correlación positiva y negativa, respectivamente.

El diagnóstico preciso de AR y PI es importante para la práctica clínica. Nuestra hipótesis es que la firma microbiana y metabólica distinta podría predecir la AR y la PI en pacientes con trasplante de pulmón. Al principio, 146 muestras se subdividieron en una cohorte de entrenamiento (104 muestras) y una cohorte de validación multirregional (42 muestras, Tabla complementaria 16). Basándonos en un enfoque de máquina de vectores de soporte (SVM), construimos modelos de aprendizaje automático empleando parámetros clínicos, incluidos recuentos sanguíneos y citoquinas séricas, y utilizamos las especies significativamente modificadas del microbioma intestinal y los metabolitos séricos significativamente alterados para distinguir AR, PI. , o EF de los sujetos (Fig. 6a – d). Al identificar AR, PI o EF, la curva de recuperación de precisión (PRC) mostró que el poder previsto de los modelos SVM basados ​​en los parámetros clínicos fue significativamente menor que los modelos que utilizaron datos de microbioma y metaboloma en las muestras validadas. Sin embargo, el microbioma único (área bajo la curva de precisión-recuperación, rango AUPRC = 0,703–0,764) y el metaboloma (rango AUPRC = 0,605–0,654) también fueron menos efectivos. Los modelos SVM basados ​​en datos multiómicos (integración de características clínicas, microbianas y metabólicas) predijeron con precisión AR, PI o EF en los sujetos validados (AUPRC = 0,801 para AR, AUPRC = 0,855 para PI y AUPRC = 0,809 para EF). Estos datos respaldaron un alto poder predictivo de las multiómicas para el diagnóstico de AR e IP en el trasplante de pulmón.

Las curvas de recuperación de precisión (PRC) de los modelos de máquinas de vectores de soporte (SVM) se basan en las características de a datos clínicos, b metabolitos séricos, c microbiota intestinal y d datos multiómicos. Las líneas roja, amarilla y verde representan el diagnóstico de AR, PI y EF, respectivamente.

En este estudio prospectivo, observacional y multicéntrico, obtuvimos un perfil multiómico completo de 146 muestras de LTR. Hasta donde sabemos, esta es la primera cohorte clínica de LTR reunida para este tipo de análisis. Al comparar los perfiles del microbioma intestinal de AR y PI con los controles de EF, encontramos una firma única de AR, con cientos de microbiomas significativamente reducidos. Además de la pérdida de diversidad microbiana intestinal, se alteraron funciones específicas, como la biosíntesis de manosa. Bacteroides uniformis fue identificado como la especie clave para la construcción de la red microbiana. Mientras tanto, varias especies intestinales alteradas, incluidas Bacteroides uniformis y Enterococcus fagos, se correlacionaron significativamente con el estado inmunológico sistémico y los metabolitos. Basándonos en el enfoque SVM, propusimos y validamos un clasificador multiómico eficaz para discriminar pacientes con AR y PI.

En varias cohortes clínicas con trasplante de órganos, los pacientes sucumben debido a la pérdida de especies “promotoras de la salud” y al crecimiento excesivo de especies “promotoras de enfermedades”.28 Haak et al. informaron que la ausencia de bacterias productoras de butirato en la microbiota fecal se asoció con una mayor susceptibilidad a la infección respiratoria en células madre hematopoyéticas alogénicas y receptores de trasplantes de riñón.29 Además, la disbiosis de la microbiota intestinal afecta el resultado clínico de varios trasplantes de órganos. Kato et al. mostraron que los Bacteroides y Streptococcus intestinales aumentaron mientras que los Enterococcus y Clostridium disminuyeron significativamente en los receptores de trasplante de hígado con AR en comparación con los receptores sanos.30 Además, Lactobacillales y Enterobacteriales se correlacionan negativamente con el estado de AR en pacientes con trasplantes intestinales.31 Sin embargo, estudios previos sobre El microbioma intestinal en el trasplante de órganos sólidos se ha visto limitado por el ARN ribosómico 16S (ARNr), que proporciona sólo una resolución limitada. De manera similar a nuestros resultados, Swarte et al. demostró que la disbiosis intestinal, incluida una menor diversidad microbiana, una mayor abundancia de especies microbianas no saludables y una menor abundancia de vías metabólicas importantes, se podía observar en receptores de trasplantes de hígado y riñón según los datos de metagenómica de escopeta de 1370 muestras fecales.12

Los estudios emergentes del microbioma en enfermedades pulmonares, como el síndrome de dificultad respiratoria aguda (SDRA) y el cáncer de pulmón, han demostrado marcadas anomalías en comparación con controles sanos en el tracto respiratorio inferior y el intestino.32,33,34,35 Dickson et al. analizaron comunidades bacterianas del líquido de lavado broncoalveolar (BALF) de pacientes con SDRA y encontraron que Bacteroides asociados al intestino, que estaban ausentes en los controles sanos, eran detectables en el 41% de las muestras.32 Estudios adicionales confirmaron que la comunidad bacteriana se caracteriza por Enterobacteriaceae predominantes y tenían una diversidad significativamente menor en los pulmones del SDRA.36 Las Enterobacteriaceae derivadas del intestino y una menor diversidad también están altamente correlacionadas con los resultados clínicos.37 Todos los estudios existentes han apoyado la existencia del "eje intestino-pulmón". Sin embargo, los mecanismos por los cuales la microbiota intestinal afecta las respuestas inmunes en los pulmones siguen sin determinarse.

La interacción entre los microorganismos y el huésped es compleja y nuestra comprensión actual de estas interacciones está en su infancia. Nuestro estudio demostró que la pérdida de Bacteroides uniformis se correlaciona negativamente con IL-1β e IL-12, y el aumento de dos citocinas podría modular la disfunción grave del aloinjerto. En particular, se informó que la administración de Bacteroides uniformis atenúa la inflamación sistémica y del tejido adiposo. , induciendo cambios en la inmunidad del huésped.22 Fabersani et al. demostraron que una mayor concentración de la citocina antiinflamatoria IL-10 estaba implicada en la inducción de Treg y la activación de las células linfoides innatas tipo 2. Por lo tanto, vale la pena seguir investigando el mecanismo subyacente a la modulación de Bacteroides uniformis en IL-1β e IL-12 en las LTR. Además, también descubrimos que la riqueza del microbioma productor de manosa está asociada con la reducción de la enfermedad de injerto contra huésped. Un análisis adicional enfatizó que el eje "pulmón-intestino" podría construirse mediante la alteración sistemática de metabolitos y citocinas causada por la comunidad microbiana con disbiosis.

La Sociedad Internacional de Trasplante de Corazón y Pulmón (ISHLT) informó que la infección grave (33,1%) y el fracaso del injerto (16,1%) fueron las principales causas de muerte dentro del año posterior al trasplante de pulmón.4 Los primeros síntomas clínicos de PI y AR, incluyendo la tomografía computarizada de tórax y los hemogramas, son similares y los tratamientos para la infección grave y el rechazo son mutuamente excluyentes. Varios estudios han demostrado que un diagnóstico temprano y preciso de AR e IP es crucial en las prácticas clínicas, lo que podría permitir el tratamiento antes de que se produzcan daños irreversibles en la función de los órganos. Se identificaron varios biomarcadores de RA, como el ADN libre de células plasmáticas y los microARN (área bajo la curva (AUC) = 0,72–0,89).38,39 Sin embargo, no existen cohortes de validación independientes en estas investigaciones. A pesar de las muestras relativamente pequeñas utilizadas para construir el modelo SVM, el poder de diagnóstico del clasificador SVM para los resultados objetivos y previstos fue muy significativo. Más importante aún, validamos este modelo multiómico en una cohorte externa independiente. Un análisis más detallado de la contribución del modelo multiómico mostró que Bacterium 1XD428 y Bacteroides uniformis contribuyeron más a la detección de AR (Tabla complementaria 17). Además, Niameybacter massiliensis y Bacteroides cutis tuvieron la mayor contribución para la detección de PI (Tabla complementaria 18). Estos hallazgos demostraron además que Bacteroides uniformis podría desempeñar un papel modificador en la patogénesis de la AR.

El presente estudio tuvo algunas limitaciones que justifican una mayor exploración. En primer lugar, la variación reconocida en los datos del microbioma intestinal entre los individuos y los factores de confusión, como el estado de la medicación y las indicaciones de trasplante de pulmón, probablemente limitó nuestro análisis para detectar biomarcadores taxonómicos y funcionales significativos adicionales para AR y PI en las LTR. Se necesitan más estudios experimentales para verificar nuestros hallazgos e investigar el mecanismo subyacente. En segundo lugar, el tiempo de seguimiento fue relativamente corto y en este estudio no se investigó la asociación entre la microbiota intestinal y CLAD. Sería interesante realizar un análisis longitudinal con un seguimiento a largo plazo de pacientes con AR, PI y CLAD si se combina con muestras recolectadas del tracto respiratorio inferior y sangre para evaluar el efecto potencial del intestino.

Utilizando un microbioma intestinal completo, citoquinas séricas y perfiles metabolómicos, presentamos un mapeo profundo de las LTR. Nuestro análisis reveló nuevos paradigmas y direcciones terapéuticas, por ejemplo, el agotamiento de Bacteroides uniformis en la RA. Puede formar la base para futuros experimentos mecanicistas, estudios preclínicos y de intervención en humanos.

Establecimos prospectivamente una cohorte (ChiCTR1900028066) de LTR en el Hospital Pulmonar de Shanghai (SPH), el primer hospital afiliado de la Universidad Médica de Guangzhou, el Hospital Changhai y el Hospital Memorial Sun Yat-sen desde mayo de 2020. Nuestro estudio tuvo como objetivo analizar la importancia clínica de Características del microbioma intestinal en LTR. Debido a los rechazos agudos graves y las infecciones que ocurren principalmente dentro del año posterior al trasplante de pulmón, limitamos todas las muestras inscritas en este período. La RA se diagnosticó y clasificó según las directrices de la ISHLT.40 El diagnóstico de IP fue confirmado por un equipo multidisciplinario que incluía cirujanos torácicos, neumólogos, patólogos y radiólogos. Se consideraron muestras de FE los casos asintomáticos y patológicos negativos según los hallazgos de las biopsias más recientes. Todas las muestras fecales y muestras de sangre pareadas se recolectaron bajo estrictas condiciones de esterilidad durante la hospitalización para vigilancia, broncoscopia o tratamiento. Se tomaron muestras de pacientes hospitalizados dentro de las 12 horas posteriores al ingreso y se almacenaron a -80 °C hasta su uso. Se podrían incluir en el análisis muestras tomadas del mismo paciente con al menos dos meses de diferencia. Este estudio obtuvo la aprobación de la Junta de Revisión Institucional de SPH (número IRB: K19-164) y se obtuvo el consentimiento informado por escrito de todos los LTR inscritos. Los ejemplares del período perioperatorio también fueron excluidos debido a la dieta irregular. Los regímenes de tratamiento específicos y los detalles de la recolección de muestras se detallan en el Material complementario.

De acuerdo con nuestro estudio anterior, el ADN genómico se extrajo de las muestras fecales mediante el kit de ADN QIAamp PowerFecal (n.° 51804, QIAGEN, EE. UU.) y la biblioteca de secuenciación para cada muestra se preparó utilizando el kit de preparación de bibliotecas KAPA HyperPlus (n.° KK8514, Roche ).41 La secuenciación Shotgun se realizó en la plataforma Illumina Novaseq 6000 en Adfontes Biotechnology Co. (Shanghai, China) para obtener lecturas de extremos emparejados directos e inversos de 150 pb. En promedio, cada muestra arrojó más de 8 G de datos sin procesar.

Las muestras de suero congeladas se descongelaron a 4 °C. El análisis LC-MS se realizó utilizando un Orbitrap Exploris 120 (Thermo Fisher Scientific, EE. UU.) y un sistema Vanquish UPLC (Thermo Fisher Scientific, EE. UU.) para un espectrómetro de masas Orbitrap Q Exactive para la detección de metabolómica no dirigida. En el Material complementario se detalla una descripción detallada de la extracción, el procesamiento de datos y el análisis de la metabolómica.

Las muestras de suero descongeladas se diluyeron dos veces y se centrifugaron a 3000 × g durante 5 minutos. Se utilizó un inmunoensayo múltiple de 27 citocinas (Bio-Rad Laboratories Inc, Hercules, CA) para analizar las citocinas y quimiocinas en el suero. Los analitos se midieron utilizando el sistema Luminex X-200 (Luminex Corp, Austin, TX). Se incluyó una curva estándar de 8 puntos por duplicado en cada placa de 96 pocillos. Los resultados con más de la mitad de las muestras por encima del límite de detección se seleccionaron para análisis posteriores.

Las lecturas de secuenciación sin procesar se preprocesaron usando Trimmomatic v0.39 para eliminar las lecturas de baja calidad.42 Se usó el software Bowtie2.4.1 para filtrar las redundantes que se originan en el host. Las lecturas de extremos emparejados con alta calidad de cada muestra se ensamblaron de novo en contigs de al menos 500 pb mediante el software SOAPdenovo v2.04 (//soap.genomics.org.cn/soapdenovo.html). Los genes fueron predichos por MetaGeneMark (v2.10, http://topaz.gatech.edu/GeneMark/). Se utilizó CD-HIT (v4.8.1, http://www.bioinformatics.org/cd-hit) para construir el catálogo de genes no redundante para los genes microbianos.43 Se mapearon lecturas de alta calidad en el catálogo de genes mediante SOAP2 software (v2.21, http://soap.genomics.org.cn/), y los recuentos de las lecturas que se alinearon con un gen se normalizaron por la longitud del gen para calcular la abundancia de cada gen en una muestra individual.44 La anotación taxonómica del catálogo de genes no redundante se realizó utilizando el software DIAMOND (v0.9.9.110, https://github.com/bbuchfink/diamond/) basado en las bases de datos NCBI NR (Versión 2018-01-02, https: //www.ncbi.nlm.nih.gov/).45 La anotación funcional del catálogo de genes no redundantes se realizó utilizando el software DIAMOND basado en la base de datos KEGG (v2019.10, http://www.kegg.jp/ barril/).

Para el análisis de diversidad alfa y diversidad beta de la microbiota intestinal, se realizaron el índice de Shannon, las especies observadas, el índice de Pielou y el PCoA basado en especies utilizando el paquete R vegan. Se utilizó la Prueba de Suma de Rangos de Wilcox de variación única para determinar las especies y características funcionales significativamente diferenciadas entre los grupos, y las diferencias se definieron como diferencias significativas cuando el FDR fue <0.1 y >2-FC.

AR y PI se combinaron en un grupo de trastornos del aloinjerto. Luego, las especies que se compartieron en más del 50% de las muestras se usaron para construir una red de asociación microbiana para los trastornos del aloinjerto o el grupo EF utilizando el software FastSpar basado en el algoritmo SparCC. Los valores de p para la correlación entre dos especies se calcularon a partir de 1000 bootstraps y se ajustaron mediante el método FDR original de Benjamini y Hochberg para obtener la significancia de las correlaciones. Los atributos de la red, como el número de nodo (vértice), el número de borde (enlace), el grado medio, la densidad, la conectividad y la ruta promedio, se calcularon utilizando el gráfico del paquete R. NetShift identificó las especies impulsadas a partir de microbiomas alterados.46 Las especies alteradas de trastornos del aloinjerto y el grupo EF se definieron como el caso y el control, respectivamente. Luego, el valor de intermediación de cada especie seleccionada se obtuvo mediante un análisis de correlación de rangos de Spearman. Los valores intermedios de especies seleccionadas se ingresaron en el paquete NetShift para calcular los núcleos NESH.

Al principio, MSConvert convirtió los datos brutos calificados al formato mzXML en el paquete de software ProteoWizard (v3.0.8789).47 Los paquetes de software XCMS se utilizaron para la detección de características, la corrección del tiempo de retención y la alineación.48 Identificamos los metabolitos por su precisión en la masa. (<20 ppm) y los datos de MS/MS y los compararon con HMDB, METLIN, MAASSBANK, LipidMaps, mzcloud y KEGG. Se aplicó la corrección robusta de la señal LOESS (QC-RLSC) para la normalización de los datos y corregir cualquier sesgo sistemático. Después de la normalización, solo se mantuvieron los picos de iones con una desviación estándar relativa inferior al 30 % en el control de calidad, lo que garantiza una identificación adecuada del metabolito. Se realizó una prueba t de Student para examinar la distribución general de los metabolitos séricos entre los grupos, con un umbral de valor de p <0,05 para considerar los metabolitos diferenciales significativos. Los metabolitos diferenciales significativos fueron visualizados por el paquete R Heatmap. Sometimos los metabolitos diferenciales a un análisis de ruta basado en MetaboAnalys.49

Para la visualización del gráfico de radar, se calcularon los valores de expresión de la mediana log10 de cada factor para cada grupo. El valor de expresión log10 más alto de todos los factores se estableció arbitrariamente en 1 y se representó como el valor máximo en las figuras correspondientes utilizando el paquete R fmsb. Utilizamos la prueba de suma de rangos de Wilcox para determinar los factores inmunes que se diferenciaron significativamente entre los grupos.

Se llevó a cabo un análisis multiómico basado en la microbiota intestinal y los datos de metabolitos séricos y citoquinas. Primero, seleccionamos especies clave de especies significativamente diferentes (AR vs EF y PI vs EF). Luego, utilizando la asociación entre la microbiota intestinal, los metabolitos séricos y las citocinas en las LTR, construimos un análisis de correlación utilizando las correlaciones de Spearman en R versión 4.1 (paquete psicológico). Las diferencias se definieron como significativas cuando el valor de p fue <0,05. Las correlaciones fueron visualizadas por el paquete R Heatmap y cyclize.

El algoritmo SVM se utilizó para construir uno versus resto para la clasificación de clases múltiples mediante scikit-learn (Python, https://github.com/j-bac/scikit-dimension).50 El resultado objetivo fue un diagnóstico de AR de PI y EF, PI de AR y EF, y EF de AR y PI. Los parámetros clínicos incluyeron recuentos sanguíneos y citocinas séricas, y las especies significativamente modificadas en el microbioma intestinal (p <0,05 y >2-FC) o los metabolitos séricos significativamente modificados (p <0,05) se utilizaron para construir modelos SVM. También se utilizó la integración de todas las variables anteriores para construir el modelo SVM. Asignamos las 104 muestras de SPH a la cohorte de formación y 42 muestras de los otros tres centros a una cohorte validada. Realizamos la validación cruzada y se utilizó la optimización de parámetros para desarrollar los modelos en las muestras de entrenamiento. Las muestras validadas se utilizaron para las pruebas. Se determinó un PRC y se calculó el AUPRC para evaluar los valores diagnósticos de los clasificadores. Identificamos que el índice de contribución de características se obtuvo identificando el mejor valor alfa, ajustando un modelo final en todo el conjunto de datos e informando la contribución de características de este modelo.

Los datos brutos metagenómicos y metabolómicos generados en este estudio se han depositado en la base de datos Genome Sequence Archive (GSA) del Centro Nacional de Datos Genómicos (NGDC, https://bigd.big.ac.cn/) con el número de acceso: PRJCA016873 .

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Los autores desean agradecer al Dr. Weiwei Yang, al Dr. Junrong Ding, al Dr. Yupin Li y al Dr. Wenxin He (Departamento de Cirugía Torácica, Hospital Pulmonar de Shanghai, Facultad de Medicina, Universidad de Tongji) por la asistencia en la recolección de muestras y interpretación de datos Este trabajo fue apoyado por el Programa Nacional Clave de Investigación y Desarrollo de China (2022YFC2504800), la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Nos. 82072257 y 82202543), el Plan de acción de Innovación Científica y Tecnológica de la Comisión de Ciencia y Tecnología de la Municipalidad de Shanghai ( Nos. 20DZ2253700, 20DZ2272000, 21410750500 y 22Y21900500), Comisión de Salud Municipal de Shanghai (shslczdzk01001) y Fundación del Departamento de Ciencia y Tecnología de Guangxi (No. 2020GXNSFGA238001).

Estos autores contribuyeron igualmente: Junqi Wu, Chongwu Li, Peigen Gao, Chenhong Zhang.

Departamento de Cirugía Torácica, Hospital Pulmonar de Shanghai, Facultad de Medicina, Universidad Tongji, Shanghai, China

Junqi Wu, Chongwu Li, Peigen Gao, Pei Zhang, Lei Zhang, Chenyang Dai, Kunpeng Zhang y Chang Chen

Centro de Investigación de Ingeniería de Trasplante de Pulmón de Shanghai, Shanghai, China

Junqi Wu, Chongwu Li, Peigen Gao, Pei Zhang, Lei Zhang, Chenyang Dai, Kunpeng Zhang y Chang Chen

Laboratorio Estatal Clave de Metabolismo Microbiano, Facultad de Ciencias de la Vida y Biotecnología, Universidad Jiao Tong de Shanghai, Shanghai, China

Chenhong Zhang

Departamento de Cirugía Torácica, Hospital Changhai, Universidad Médica Naval, Shanghai, China

Bowen Shi

Departamento de Cirugía Torácica, Primer Hospital Afiliado de la Universidad Médica de Guangzhou, Guangzhou, China

Mengyang Liu

Departamento de Cirugía Cardiovascular, Hospital Conmemorativo Sun Yat-sen, Universidad Sun Yat-sen, Guangzhou, China

Jun Meng Zheng

Departamento de Dermatología, Laboratorio Clave de Micología Médica Molecular de Shanghai, Hospital Changzheng de Shanghai, Universidad Médica Naval, Shanghai, China

Bo Pan, Chao Zhang, Wanqing Liao, Weihua Pan y Wenjie Fang

Adfontes (Shanghai) Bio-technology Co., Ltd, Shanghai, China

Zhan Chen

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CC tuvo acceso completo a todos los datos del estudio y asume la responsabilidad de la integridad de los datos y la precisión del análisis de los datos. Todos los autores leyeron y aprobaron la versión final del manuscrito. Concepto y diseño: CC, WF, WP y WL Adquisición, análisis o interpretación de datos: JW, CL, PG, PZ, LZ, CD, KZ, BS, ML, JZ, BP, Chao Zhang y Chenhong Zhang. Redacción del manuscrito: JW, CL, PG y WF Revisión crítica del manuscrito para contenido intelectual importante: Chenhong Zhang, WP, CC y WL Análisis estadístico: JW, CL, ZC y Chenhong Zhang. Supervisión: CC

Correspondencia a Weihua Pan, Wenjie Fang o Chang Chen.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Acceso Abierto Este artículo está bajo una Licencia Internacional Creative Commons Attribution 4.0, que permite el uso, compartir, adaptación, distribución y reproducción en cualquier medio o formato, siempre y cuando se dé el crédito apropiado a los autores originales y a la fuente. proporcione un enlace a la licencia Creative Commons e indique si se realizaron cambios. Las imágenes u otro material de terceros en este artículo están incluidos en la licencia Creative Commons del artículo, a menos que se indique lo contrario en una línea de crédito al material. Si el material no está incluido en la licencia Creative Commons del artículo y su uso previsto no está permitido por la normativa legal o excede el uso permitido, deberá obtener permiso directamente del titular de los derechos de autor. Para ver una copia de esta licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

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Wu, J., Li, C., Gao, P. et al. La microbiota intestinal se vincula con la estabilidad del aloinjerto después del trasplante de pulmón: un estudio de cohorte prospectivo. Sig Transduct Target Ther 8, 326 (2023). https://doi.org/10.1038/s41392-023-01515-3

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Recibido: 31 de julio de 2022

Revisado: 17 de mayo de 2023

Aceptado: 28 de mayo de 2023

Publicado: 01 de septiembre de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41392-023-01515-3

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